99mTc-EDTA-MN的制備及其在荷瘤裸鼠顯像中的初步評價(jià)

齊永帥 李貴平 池曉華 杜麗 黃凱 張輝 黃寶丹

目前認(rèn)為在實(shí)體腫瘤中，由于腫瘤生長迅速，造成腫瘤細(xì)胞往往處于缺氧狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞的乏氧程度越高，這些細(xì)胞對放療和化療的敏感性越差，臨床上很難被徹底殺死。乏氧顯像作為檢測腫瘤組織乏氧程度的一種無創(chuàng)傷性手段，對于最佳治療方案的選擇、監(jiān)測療效以及預(yù)后評價(jià)具有重要意義[1-5]。本研究應(yīng)用放射性核素標(biāo)記技術(shù)對研制具有臨床應(yīng)用價(jià)值的腫瘤乏氧顯像劑EDTA-MN配體進(jìn)行標(biāo)記。99mTc-乙二胺四乙酸-甲硝唑酯（ethylenediaminetetraacetic acid-metronidazole, EDTAMN）是一種2-硝基咪唑類化合物，其中EDTA是一種常見且易得的絡(luò)合劑，為雙功能螯合劑；MN是硝基咪唑類化合物，作為靶向基團(tuán)濃聚于乏氧組織中，其材料來源廣泛。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c裸鼠3只，5周-6周齡，體重20 g左右，SPF級，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器 試劑：廣東化工大學(xué)輕工業(yè)學(xué)院惠贈EDTA-MN配體（圖1）；氯化亞錫（SnCl2）購于廣東光華科技股份有限公司；抗壞血酸（VitC）購于成都市科龍化工試劑廠；高锝酸鈉淋洗液來源于原子高科股份有限公司；無水乙腈購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；以上試劑均為分析純。聚酰胺膜購于上海摩速科學(xué)器材有限公司；Millex?GS 0.22 μm微孔過濾器購于美國Milipore公司。儀器：高效液相系統(tǒng)購于美國Dionex公司；Radio-TLC薄層掃描儀（Bioscan AR-2000）購于美國Bioscan公司；FA604A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；600型恒溫水箱（江蘇金壇市中大儀器廠）；ZD-3回旋振蕩器（天津市歐諾儀器表有限公司）；SN-682型放射免疫γ計(jì)數(shù)器（上海核福光電儀器有限公司）；Milliennium VG 型SPECT顯像儀由美國GE公司生產(chǎn)；FJ-391A2型微機(jī)放射性活度計(jì)由北京核儀器廠生產(chǎn)。

1.3 EDTA-MN配體的99mTc標(biāo)記 采用氯化亞錫還原法法進(jìn)行EDTA-MN配體的99mTc標(biāo)記，分別對EDTA-MN配體反應(yīng)量（10 mg、5 mg、2 mg）、氯化亞錫用量（8 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL）、標(biāo)記體系pH（2、4、5、6）逐一進(jìn)行試驗(yàn)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，以尋找最佳標(biāo)記條件。將含有一定量 EDTA-MN配體的水溶液和新鮮配制0.04 mL SnCl2·2H2O的HCl溶液（0.02 mol/L HCl溶液）依次加入青霉素瓶，調(diào)節(jié)溶液pH值，隨即加入1 mL高锝酸鈉淋洗液（37 MBq），最后再加入30 mg/mL抗壞血酸0.08 mL溶液，于青霉素瓶置于100 ℃水浴中加熱20 min。

1.499mTc-EDTA-MN的標(biāo)記率和放化純度測定 標(biāo)記率測定：采用紙層析法，固相為聚酰胺膜，展開劑為60%乙腈水溶液，99mTcO4-、99mTc-膠體、99mTc-EDTA-MN的Rf值分別為0.3-0.5、0.1、0.7-1.0[6]。HPLC純化：采用Kromasil 100-5C18反相柱（250 mm×4.6 mm），流動(dòng)相為純水與甲醇，A相為純水，B相為甲醇，進(jìn)樣量5 μL，泵流速1 mL/min。

1.599mTc-EDTA-MN體外穩(wěn)定性測定 經(jīng)HPLC純化后的99mTc-EDTA-MN分別于室溫中放置1 h、3 h、6 h、12 h，然后取少量樣品紙層析法測定放化純度，觀察其體外穩(wěn)定性。

1.699mTc-EDTA-MN的脂水分配系數(shù)測定 取1 mL 0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）加入10 mL離心試管，再加入1 mL正辛醇和0.01 mL99mTc-EDTA-MN溶液，蓋上塞子，振蕩、搖勻，離心5 min（4,000 r/min）。然后分別從無機(jī)相和有機(jī)相中取出0.1 mL，測定二相的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算其脂水分配系數(shù)P（P=有機(jī)相的放射性活度/無機(jī)相的放射性活度）。

1.7 荷瘤A549裸鼠模型建立及腫瘤初步顯像 取5周-6周齡BALB/c裸鼠3只，體重20 g左右，于右側(cè)腹壁皮下接種A549細(xì)胞2×106/只，待腫瘤生長至直徑1 cm左右時(shí)用于顯像。經(jīng)尾靜脈注射標(biāo)記物 4.62 MBq（0.1 mL），采用低能高分辨準(zhǔn)直器，于0.5 h、1 h、2 h、3 h行單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)（single-photon emission computed tomography, SPECT）平面顯像，能峰為140 KeV，矩陣256×256，放大倍數(shù)2.0，采集計(jì)數(shù)700 k左右，初步觀察顯像劑在腫瘤病灶的濃聚情況，利用感興趣區(qū)（region of interest, ROI）技術(shù)，計(jì)算腫瘤單位面積內(nèi)攝取放射性計(jì)數(shù)以及腫瘤/肝臟區(qū)域的放射性計(jì)數(shù)比值（T/NT）。

2 結(jié)果

2.199mTc-EDTA-MN的最佳標(biāo)記條件 EDTA-MN用量5 mg、SnCl2·2H2O用量4 mg/mL、pH值5.0-6.0、反應(yīng)時(shí)間20 min-30 min及反應(yīng)溫度100 ℃為標(biāo)記物最佳標(biāo)記條件，該條件下得到標(biāo)記率為（84.11±2.83）%。

2.299mTc-EDTA-MN的標(biāo)記率和放化純度測定 最佳標(biāo)記條件下，99mTc-EDTA-MN的標(biāo)記率＞80%，薄層掃描結(jié)果如圖2所示。HPLC結(jié)果顯示制備得到的99mTc-EDTA-MN為一單峰，標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)記物在320 nm處紫外吸收峰基本一致，標(biāo)記物的保留時(shí)間約為4 min，放射性化學(xué)純度大于90%（圖3）。

2.299mTc-EDTA-MN體外穩(wěn)定性測定 室溫下在生理鹽水中放置1 h、3 h、6 h、12 h后，99mTc-EDTA-MN的放化純度分別為（93.26±1.10）%、（91.97±0.51）%、（90.15±0.63）%、（88.03±0.11）%。結(jié)果表明其放射性化學(xué)純度＞90%，在室溫下標(biāo)記物具有良好的體外穩(wěn)定性。

圖1 配體EDTA-MN的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig1 Chemical structures of EDTA-MN

圖2 99mTc-EDTA-MN標(biāo)記率測定的薄層掃描結(jié)果Fig2 Thin layer chromatography scanning after 99mTc labeling EDTAMN ligand

圖3 99mTc-EDTA-MN的高效液相色譜圖Fig3 HPLC chromatogram of 99mTc-EDTA-MN

2.399mTc-EDTA-MN的脂水分配系數(shù)測定 本試驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)公式計(jì)算得到的平均LogP值，試驗(yàn)測得99mTc-EDTA-MN的LgP=-3.05，表明為親水性更強(qiáng)的物質(zhì)。

2.4 荷瘤A549裸鼠模型建立及腫瘤初步顯像 荷瘤裸鼠尾靜脈注射標(biāo)記物后，0.5 h時(shí)膀胱區(qū)見大量放射性濃聚，腫瘤部位有放射性濃聚，1 h左右即可顯像清晰，余器官如腦、肺、肝、脾、腎、胃、小腸及肌肉未見明顯放射性濃聚（圖4）。采用ROI技術(shù)測得0.5 h、1 h、2 h、3 h腫瘤部位單位面積內(nèi)放射性計(jì)數(shù)分別為88.14±11.59、123.17±9.06、98.08±14.40和79.87±10.57，并計(jì)算腫瘤與肝臟區(qū)域的T/NT比值分別為1.95±0.19、3.58±0.78、3.95±0.39和5.01±0.28。

圖4 99mTc-EDTA-MN在非小細(xì)胞（A549）肺癌裸鼠模型的不同時(shí)間顯像Fig4 99mTc-EDTA-MN imaging of lung tumor in nude mouse bearing A549 cell at different time points

3 討論

作為腫瘤乏氧顯像劑，放射性核素標(biāo)記的硝基咪唑類化合物目前已得到廣泛的研究。全面了解硝基咪唑類乏氧細(xì)胞顯像劑有效地合成方法，將有助于研究者優(yōu)化目標(biāo)配合物的設(shè)計(jì)和選擇高效簡潔的合成方式，從而推動(dòng)先導(dǎo)配合物的發(fā)現(xiàn)與結(jié)構(gòu)優(yōu)化[5,7-9]。放射性核素標(biāo)記分為直接法和間接法，本研究采用99mTc氯化亞錫還原法與雙功能螯合劑EDTA分子絡(luò)合，利用甲硝唑作為靶向基團(tuán)濃聚于乏氧組織特點(diǎn)，制備毒性低且穩(wěn)定性好的99mTc-EDTA-MN乏氧顯像劑。在最佳標(biāo)記條件下，99mTc-EDTAMN得到標(biāo)記率達(dá)到80%以上，放化純度大于90%，并且室溫下在生理鹽水中放置12 h具有良好的體外穩(wěn)定性。標(biāo)記物經(jīng)HPLC分析，EDTA-MN標(biāo)準(zhǔn)品和99mTc-EDTA-MN的主放射峰值時(shí)間約為4 min，且在320 nm處紫外檢測峰基本一致，表明99mTc已成功標(biāo)記于EDTA-MN上。

近年來報(bào)道的99mTc標(biāo)記的硝基咪唑類乏氧細(xì)胞顯像劑普遍存在一些不足：①腫瘤攝取值偏低，顯像時(shí)間較晚，體內(nèi)解離快；②肝臟攝取值偏高，肝內(nèi)活性清除能力差，不利于腹部腫瘤的成像；③腫瘤/血液的比值偏低，藥物在血液中清除緩慢。荷瘤裸鼠顯像初步結(jié)果：30 min時(shí)膀胱內(nèi)可見大量放射性濃聚，1 h左右腫瘤即可顯影清晰，3 h時(shí)腫瘤部位仍有較多放射性滯留，而腦組織、軟組織、甲狀腺、胃腸道等部位放射性分布明顯降低，表明：①標(biāo)記物在裸鼠體內(nèi)血清除較快，親水性好，主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，其余臟器內(nèi)放射性均較低，有利于減輕對其他器官或組織的輻射損傷；②標(biāo)記物在體內(nèi)比較穩(wěn)定，無明顯脫標(biāo)現(xiàn)象。但肝臟有一過性濃聚，經(jīng)過肝臟代謝致使99mTc-EDTA-MN在血液中迅速清除，則有利于降低本底，增加靶/非靶組織放射性比值。雖然裸鼠顯像示瘤體部位有較高的攝取和很好的滯留，但仍需要進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)，測定各個(gè)臟器的組織重量與其放射性計(jì)數(shù)得出相應(yīng)的%ID/g，計(jì)算腫瘤攝取值、腫瘤/血液比值、腫瘤/肌肉比值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以尋求高效低毒、穩(wěn)定性好、結(jié)合性強(qiáng)的乙二胺四乙酸-甲硝唑酯乏氧細(xì)胞顯像劑。

綜上所述，放射性核素標(biāo)記硝基咪唑類化合物作為乏氧細(xì)胞顯像劑是非常具有應(yīng)用前景的腫瘤診斷藥物。

致謝：感謝廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室郝志峰教授惠贈EDTA-MN。