旋毛蟲(chóng)寄生致小鼠十二指腸組織細(xì)胞凋亡

李丹，羅靖梅，趙蕾，邴玉艷，杜孌英

（承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000）

旋毛形線蟲(chóng)（Trichinella spiralis）簡(jiǎn)稱(chēng)旋毛蟲(chóng)，是一種重要的人獸共患寄生蟲(chóng)，具有極強(qiáng)的感染能力，能夠引起幾乎所有哺乳動(dòng)物和人的旋毛蟲(chóng)病[1]。其生活史可分為成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)兩個(gè)階段，成蟲(chóng)寄生于宿主的小腸內(nèi)，是旋毛蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的早期階段[2]。幼蟲(chóng)在小腸內(nèi)脫囊并鉆入腸黏膜發(fā)育為成蟲(chóng)的過(guò)程為侵入期，是旋毛蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵階段，擬通過(guò)采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)感染小鼠模型十二指腸組織細(xì)胞凋亡情況，為旋毛蟲(chóng)的早期診斷和治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

旋毛蟲(chóng)株（河南株）由承德醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室小鼠傳代保種。實(shí)驗(yàn)用昆明雄性健康成年小鼠，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自承德醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。重要試劑：TUNEL試劑盒，美國(guó)Roche公司；兔抗Caspase-3抗體，美國(guó)sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

40只小鼠隨機(jī)分為4組，即旋毛蟲(chóng)感染3、5、7 d組及正常對(duì)照組，每組10只。

1.3 動(dòng)物模型的建立[3-4]

處死河南株保蟲(chóng)小鼠1只，全身骨骼、肌肉稱(chēng)質(zhì)量，組織搗碎機(jī)充分?jǐn)嚢?，獲得混懸液，調(diào)整混懸液中的幼蟲(chóng)密度至200條幼蟲(chóng)/0.2 mL，經(jīng)灌胃方式感染小鼠，建立動(dòng)物模型。

1.4 標(biāo)本組織蘇木素-伊紅（HE）染色

分別取感染3、5、7 d組和正常對(duì)照組小鼠十二指腸，于10%的甲醛溶液內(nèi)固定24 h，經(jīng)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、HE染色后于顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.5 原位末端標(biāo)記（TUNEL）染色

按照美國(guó)Roche公司提供的試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)十二指腸組織進(jìn)行切片，60 ℃烤片后常規(guī)脫蠟、水化，蒸餾水、PBS水洗2次每次5 min，加入TUNE反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)后滴加50～100 μL DAB顯色液顯色3～10 min，后經(jīng)蘇木素復(fù)染、中性樹(shù)膠封片一系列步驟進(jìn)行TUNEL染色。感染3、5、7 d的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別選取5個(gè)不同組織塊的切片各1張，光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核染成深棕色為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核染成深藍(lán)色為陰性細(xì)胞。定量分析方法為計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=一定范圍內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)/一定范圍內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 Western-blot法分析Caspase-3變化

分別取正常對(duì)照組和感染3、5、7 d小鼠十二指腸組織，經(jīng)組織蛋白提取、BCA蛋白濃度測(cè)定、蛋白處理、電泳、轉(zhuǎn)膜、兔抗Caspase-3多克隆抗體1∶200倍稀釋?zhuān)? ℃下孵育過(guò)夜、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育以1∶5000倍稀釋?zhuān)瑩u床搖1 h，經(jīng)TBST洗3次后顯影、定影，最后采用Quantity One軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常對(duì)照組小鼠十二指腸組織未見(jiàn)任何病理變化；感染3 d組十二指腸黏膜層上皮細(xì)胞水腫不明顯，黏膜層稍見(jiàn)出血；感染5 d組十二指腸黏膜層上皮細(xì)胞可見(jiàn)輕微水腫，黏膜層腸腺可見(jiàn)明顯出血，炎細(xì)胞較少，固有膜明顯空泡狀改變；感染7 d組十二指腸黏膜層大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并伴有大量出血，局部黏膜上皮細(xì)胞水腫，固有膜空泡狀改變更加明顯，腸絨毛缺損。見(jiàn)圖1。

圖1 不同感染時(shí)間小鼠十二指腸組織HE染色結(jié)果（×200）

2.2 TUNEL法檢測(cè)結(jié)果

正常對(duì)照組十二指腸黏膜層可見(jiàn)零星散在的細(xì)胞核呈深棕色或棕黃色的凋亡細(xì)胞。旋毛蟲(chóng)感染3 d、5 d、7 d組十二指腸黏膜層可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖2。且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡指數(shù)亦明顯增多，組與組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

圖2 不同感染時(shí)間小鼠十二指腸組織TUNEL染色結(jié)果（×200）

表1 不同感染時(shí)間的十二指腸組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（）

表1 不同感染時(shí)間的十二指腸組織細(xì)胞凋亡指數(shù)（）

F=29.208，P=0.001。與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；感染3、5、7 d 組間兩兩比較，P<0.05。

組別 n 細(xì)胞凋亡指數(shù)正常對(duì)照組 10 0.08±0.02感染 3 d 10 0.26±0.03a感染 5 d 10 0.38±0.03a感染 7 d 10 0.73±0.09a

2.3 Western-blot法檢測(cè)結(jié)果

Western-blot結(jié)果分析Caspase-3變化結(jié)果顯示，隨著旋毛蟲(chóng)感染時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠十二指腸組織Caspase-3蛋白的表達(dá)量隨之增多，與正常對(duì)照組比較P<0.05，3、5、7 d組間兩兩比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 不同感染時(shí)間Caspase-3變化結(jié)果

表2 旋毛蟲(chóng)小鼠十二指腸組織Caspase-3蛋白的表達(dá)（）

表2 旋毛蟲(chóng)小鼠十二指腸組織Caspase-3蛋白的表達(dá)（）

F=32.012，P=0.001。與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；感染3、5、7 d 組間兩兩比較，P<0.05。

組別 n Caspase-3 表達(dá)量正常對(duì)照組 10 0.79±0.03感染 3 d 10 0.86±0.03a感染 5 d 10 1.04±0.02a感染 7 d 10 1.34±0.02a

3 討論

旋毛蟲(chóng)病是呈世界性分布的食源性人獸共患寄生蟲(chóng)病，目前在66個(gè)國(guó)家或地區(qū)有旋毛蟲(chóng)病分布[5]。近年來(lái)其流行范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，發(fā)病率有逐漸增高的趨勢(shì)[6-7]。旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)寄生于宿主的消化道內(nèi)，是旋毛蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的早期階段，主要寄生在宿主的十二指腸和空腸上段，引起十二指腸和空腸局部充血、水腫。過(guò)去的研究主要局限于旋毛蟲(chóng)對(duì)宿主的機(jī)械性損傷。近年，寄生蟲(chóng)與宿主相互作用中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，日益受到重視，但目前主要集中在蠕蟲(chóng)與少量原蟲(chóng)上[8-9]，關(guān)于細(xì)胞凋亡在旋毛蟲(chóng)和宿主相互作用中研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)病理學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)旋毛蟲(chóng)感染小鼠不同時(shí)間宿主十二指腸組織的細(xì)胞凋亡情況，探討旋毛蟲(chóng)感染狀態(tài)下宿主被寄生部位組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)理，以選擇性地促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，為預(yù)防、治療、殺滅旋毛蟲(chóng)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是指機(jī)體為維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的、主動(dòng)的、高度有序的及一些系列酶參與的過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用HE染色、Western-blot技術(shù)、TUNEL法證實(shí)了旋毛蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中可誘導(dǎo)小鼠十二指腸組織發(fā)生細(xì)胞凋亡。通過(guò)HE染色證實(shí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型建立成功，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠基礎(chǔ)。利用Western-blot法對(duì)感染小鼠十二指腸組織進(jìn)行研究，結(jié)果顯示感染3、5、7 d組小鼠十二指腸組織Caspase-3表達(dá)量明顯高于正常組，隨著旋毛蟲(chóng)感染時(shí)間延長(zhǎng)，Caspase-3表達(dá)量增加。采用TUNEL法對(duì)小鼠十二指腸組織進(jìn)行染色，結(jié)果顯示旋毛蟲(chóng)感染3、5、7 d組十二指腸黏膜層可見(jiàn)明顯凋亡細(xì)胞，且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞數(shù)不斷增加，與本實(shí)驗(yàn)做出的Western-blot結(jié)果一致。

宿主細(xì)胞凋亡與寄生蟲(chóng)的作用時(shí)間存在相互依賴(lài)的關(guān)系已被研究者證實(shí)，劉文杰等[10]發(fā)現(xiàn)，在血吸蟲(chóng)感染過(guò)程中，CD4+和CD8+細(xì)胞的促進(jìn)凋亡基因的表達(dá)隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。李繼紅[11]研究表明，旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞凋亡呈時(shí)間依賴(lài)性，并以生長(zhǎng)旺盛階段最為明顯，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

實(shí)驗(yàn)證實(shí)旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)在宿主轉(zhuǎn)換過(guò)程中，可以起感染期作用，引起宿主的旋毛蟲(chóng)感染，但可能大部分人認(rèn)為旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)的生存周期短而且人們食入成蟲(chóng)的機(jī)會(huì)不多，但動(dòng)物的腸肚煮沸不足或生拌涼肚給成蟲(chóng)感染提供了機(jī)會(huì)。另外動(dòng)物間的相互蠶食，使之可能以腸道成蟲(chóng)的形式受到感染，在人類(lèi)大量捕殺饕餮野生動(dòng)物的今天，無(wú)疑給人類(lèi)的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。早期診斷和治療對(duì)旋毛蟲(chóng)患者至關(guān)重要，因此，了解旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)期的發(fā)病機(jī)制與生物學(xué)特征對(duì)旋毛蟲(chóng)病的預(yù)防和治療有很大的意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了旋毛蟲(chóng)感染可誘導(dǎo)其寄生部位組織發(fā)生細(xì)胞凋亡，為旋毛蟲(chóng)的發(fā)病機(jī)制和治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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