核桃基腐病拮抗細菌的篩選與初步鑒定

劉曉琳+肖俊文+王曉煒+馬榮+趙祥+阿地力·沙塔爾

摘 要：核桃基腐病已成為影響核桃生產(chǎn)的重要病害之一，為了得到對核桃基腐病有拮抗作用的拮抗菌株，采用組織分離法，在分離核桃基腐病過程中得到細菌，利用平板對峙法，最終篩選得到1株拮抗效果較強的菌株GY-11，對核桃基腐病的拮抗效果達到80%。結合形態(tài)學特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析鑒定該拮抗細菌菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

關鍵詞：核桃基腐??；拮抗細菌；篩選；鑒定

中圖分類號：S436.64 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.07.021

Abstract： Walnut stalk rot （Pythium oligandrum） has become one of the important diseases that affect walnut industry in Xinjiang. Antagonistic bacteria strains GY-11 was got from flat confrontation culture， while its bacteriostatic rate was 80% to Pythium oligandrum. The bacterial colony and thalli shape， physiological and biochemistry experiments and determination of the sequence of 16S rDNA of the bacteria had been done. The strain GY-11 was identified as Bacillus subtilis.

Key words： walnut stalk rot； antagonistic bacteria； isolation； identification

核桃（Juglans regia L.） 屬落葉喬木，是我國重要的經(jīng)濟樹種，具有豐富的營養(yǎng)價值和保健功能，可制取食用油和制作各種食品[1]。核桃作為新疆的第二大果樹，其種植面積占全疆林果總面積的四分之一[2]，是農村經(jīng)濟發(fā)展的重要支柱之一。核桃適生范圍廣，常被栽植于山區(qū)和田園，是重要的用材樹種和生態(tài)樹種[3]。近幾年，新疆核桃種植面積逐漸擴大，由于大面積種植單一品種、管理粗放以及栽培模式等原因，病蟲害問題日益增多，尤其是核桃基腐?。≒ythium oligandrum Drechsler），嚴重制約了核桃的健康發(fā)展。

目前，防治核桃基腐病的方法主要以化學方法為主，通過大田試驗篩選出了咪酰胺等防效較好的藥劑[4]。常規(guī)的化學藥劑在防治核桃基腐病方面，有經(jīng)濟、高效和方便等優(yōu)勢，但其易被環(huán)境污染，不利于打造生態(tài)健康果園。最近幾年通過生防菌株防治果樹病害已成為一種重要的防治手段，目前應用較多的拮抗細菌主要有芽孢桿菌 Bacillus subtilis、假單胞桿菌Pseudomonas spp.、土壤放射桿菌 Agrobacterium radiobacter 等[5]。然而通過拮抗菌株防治核桃基腐病的研究尚未見報道。因此，篩選出抗菌譜廣、生防活性高及對環(huán)境安全的新型拮抗細菌，制備成高效的生防菌劑，對該病害的防治具有重要意義。本研究從分離核桃基腐病病原菌過程中獲得細菌，并通過平板對峙培養(yǎng)法篩選出抑制效果的生防細菌，并對其進行種類鑒定，以期為生防菌株的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株：核桃基腐病病原菌由新疆農業(yè)大學林學與園藝學院病理實驗室提供。

培養(yǎng)基：核桃基腐病病原菌的培養(yǎng)和拮抗菌株的分離采用PDA培養(yǎng)基；拮抗菌的純化采用NA培養(yǎng)基；拮抗菌的液體培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基；生理生化特性的測定需要采用耐鹽性試驗培養(yǎng)基、淀粉水解試驗培養(yǎng)基、V.P試驗培養(yǎng)基、吲哚產(chǎn)生試驗培養(yǎng)基、甲基紅試驗培養(yǎng)基、卵磷脂酶試驗培養(yǎng)基、菌膜形成試驗培養(yǎng)基、接觸酶試驗培養(yǎng)基、需氧性測定試驗培養(yǎng)基。

1.2 拮抗菌株的分離

拮抗菌株的分離采用常規(guī)組織分離法。核桃基腐病病害標本采集于新疆和田地區(qū)墨玉縣，在材料的病健交界部位切成5 mm的組織塊，用 75%乙醇消毒30 s、1%次氯酸鈉消毒90 s，無菌水沖洗3次，最后將組織塊放置于 PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，將長出的細菌菌落在NA平板上劃線法純化后，將單菌落于4 ℃保存。

1.3 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法。將上述分離到的細菌活化培養(yǎng)后，等距離（距離病原菌2 cm左右）劃線至已接種核桃基腐病病原菌的PDA平板上，以只接病原菌為對照，每個處理3個重復。28 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照菌絲即將長滿時，測量細菌菌株與病原菌之間的抑菌帶寬度[6]，計算抑制率：

抑制率=（對照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對照平板菌落直徑×100%

1.4 拮抗菌株在不同時間段的生長情況

挑取單菌落接種于含有50 mL NB培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，震蕩培養(yǎng)24 h （28 ℃、180 r·min-1），制成種子液。取盛有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶25個，分別編號為0，2，4，6，8， 10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46，48 h。

取2 mL種子液，接種于50 mL NB 培養(yǎng)基中，180 r·min-1，28 ℃振蕩培養(yǎng)。以滅菌NB培養(yǎng)基為對照，分別從對應時間的三角瓶取出培養(yǎng)液，測定OD600值。根據(jù)測定數(shù)值繪制生長曲線[6-7]。

1.5 拮抗菌株的鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學和生理生化特性測定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]和《芽孢桿菌屬》[9]中介紹的方法，觀察菌株及菌落形態(tài)，測定拮抗細菌的需氧特征、NaCl耐受度、檸檬酸鹽利用、丙二酸鹽利用、接觸酶、V-P試驗、甲基紅試驗、明膠液化等生理生化指標。

用接種針分別挑取24 h培養(yǎng)的菌株，分別接種于PDA、PSA的液體培養(yǎng)基和NB、LB培養(yǎng)基，封口，180 r·min-1，28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，測定OD600值，觀察菌株的最適培養(yǎng)基。

1.5.2 菌株的分子生物學鑒定 通過試劑盒提取菌株的DNA，采用引物對63f （5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'）和1387r （5'- ACGGCTACCTTGTTACGACT -3'），進行PCR反應。PCR反應體系為50 μL： 模板DNA 2.5 μL，引物各2.5 μL，dNTP 4 μL，10×Buffer 5 μL，Taq 聚合酶0.5 μL，ddH2O補足50 μL。PCR擴增條件： 94 ℃預變性3 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠成像檢測，PCR產(chǎn)物由北京天根生物有限公司進行測序，序列經(jīng) ClustalX 1.83比對、校正和編輯后，用MEGA5.0軟件中的NJ法（Neighbor-Joining，鄰接法）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，應用自展法（bootstrap）檢驗系統(tǒng)樹，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。以Amphibacillus xylanus作為外群[10]。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

將分離得到的菌株，通過與核桃基腐病病原菌平板對峙培養(yǎng)，篩選得到3株拮抗效果較好的細菌菌株，其中僅有菌株GY-11具有較強的拮抗的效果，抑制率達到80%。因此，選用菌株GY-11做進一步研究。

2.2 拮抗菌株在不同時間段的生長情況

菌株GY-11在 NB 培養(yǎng)液中的生長情況（圖1），菌株在0～4 h 生長較慢，4～10 h 生長最快，菌株量呈典型的對數(shù)；在10～30 h的時間段菌體的生長量變化不大，達到穩(wěn)定期；在30～48 h菌株的生長量有明顯的下降趨勢，此后進入衰亡期。

2.3 拮抗菌株的初步鑒定

2.3.1 菌株的形態(tài)學和生理生化特征 菌株在不同培養(yǎng)基上生長存在一定差異，在NA培養(yǎng)基上生長最好，其次是PDA。菌株GY-11在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后觀察，其單菌落為圓形，乳白色，白色邊緣不圓滑似圓形，表層不規(guī)則突起，褶皺明顯。顯微觀察，菌體為桿狀，革蘭氏染色呈現(xiàn)紫色，鞭毛特征不明顯，為革蘭氏陽性菌。

生理生化特性表明：菌株為革蘭氏陽性菌，厭氧菌，有氧條件下生長微弱；最適的生長溫度為27 ℃；在含有5%或7%NaCl的液體培養(yǎng)基上生長良好，鹽度越高，生長越緩慢，說明菌株耐鹽性一般；不能利用檸檬酸鹽做碳源；菌株過氧化氫試驗為陽性反應；可使明膠液化；有菌膜形成；甲基紅試驗呈陽性反應；V-P試驗為紅色，為陽性反應（表1）。形態(tài)學與生理生化特征的鑒定結果表明，菌株GY-11與芽胞桿菌屬的描述一致。

2.3.2 分子生物學鑒定 將測序結果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對，Blast結果表明，菌株與枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis的16S rDNA序列同源性為99%，在GenBank注冊的序列號為KP876486。從基于鄰接法構建的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）可以發(fā)現(xiàn)：菌株GY-11與模式菌株枯草芽孢桿菌（KF496886）聚類在同一大分支內（支持率99%），并結合菌株的形態(tài)學及生理生化特征，最終確定菌株GY-11為枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis。

3 結論與討論

本研究通過常規(guī)組織分離病原菌得到細菌菌株，利用平板對峙法，篩選出拮抗菌株GY-11，其拮抗效果達到80%。利用形態(tài)學、生理生化特性和分子生物學技術鑒定該拮抗菌株為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。

拮抗細菌防治植物病害是當今植病界十分活躍的研究領域之一，并已顯示出良好的應用前景[11]。目前用芽孢桿菌制備生防制劑防治植物病害的研究已成為國內外研究的熱點，有關芽孢桿菌在植物生物防治上的應用報道很多，其具有生長快、營養(yǎng)簡單、抗性強、易存活與繁殖以及對人畜無害、不污染環(huán)境、制劑穩(wěn)定和施用方便等優(yōu)點，符合綠色食品的要求，且為農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障[12]。枯草芽孢桿菌對多種植物的多種病害都具有防治作用[13-15]，但是對核桃基腐病的防治研究未見有報道。本研究通過試驗篩選得到一株對核桃基腐病病原菌有較好抑制效果的枯草芽孢桿菌菌株GY-11。本研究僅對拮抗菌株的分類地位和培養(yǎng)時間開展了研究，后期擬進一步開展關于拮抗菌株的最適碳氮源、最適發(fā)酵條件的研究，以期為該菌株進一步的開發(fā)應用奠定理論基礎。

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