miR-30b在膀胱癌中表達(dá)的臨床意義及對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響研究

李利軍，邱明星，馬志偉，龔百生

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院泌尿外科，四川 成都 610072)

膀胱癌是最常見的泌尿生殖系統(tǒng)癌癥，是影響患者健康及生命安全的惡性疾病，發(fā)病率及死亡率均較高。目前臨床對(duì)于此類疾病主要采用手術(shù)切除為主，化療、放療等綜合治療為輔，但療效均不理想[1，2]。尋找膀胱癌的發(fā)病基因，從遺傳學(xué)途徑了解膀胱癌的發(fā)生機(jī)制，是膀胱癌診療的基礎(chǔ)[3]。MicroRNA是一種內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的小分子RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，研究表明[4，5]，miRNA能夠參與癌細(xì)胞的各項(xiàng)生物學(xué)過(guò)程，如增殖、分化、凋亡等，miRNA具有組織特異性、時(shí)序性及保守性的特點(diǎn)，因此有學(xué)者認(rèn)為miRNA屬于新層次上的基因表達(dá)調(diào)控，miRNA的表達(dá)可能作為腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)。miR-30b是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)異常表達(dá)的一類miRNA，研究顯示，miR-30b具有一定的抑癌基因功能[6]。但國(guó)內(nèi)對(duì)于miR-30b在膀胱癌中的表達(dá)尚缺少研究。本文就miR-30b與膀胱癌的相關(guān)性，及miR-30b對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響進(jìn)行了研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2012年7月至2015年9月我院泌尿外科32例膀胱癌手術(shù)患者，男21例，女11例，年齡42～76歲[(61.3±4.9)歲]。均行膀胱切除術(shù)治療，病理檢驗(yàn)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌，取標(biāo)本前均未進(jìn)行過(guò)放化療或免疫治療。除取患者的腫瘤組織標(biāo)本外，同時(shí)取距離腫瘤邊緣3～5 cm的正常組織作為對(duì)照標(biāo)本，每份標(biāo)本分別置于液氮罐及福爾馬林溶液中進(jìn)行保存，固定后石蠟包埋送病理診斷。臨床分期標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟2002年的TNM分期法[7]，病理分期標(biāo)準(zhǔn)參照WHO1973分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞及試劑來(lái)源 膀胱癌細(xì)胞T24、5637來(lái)自于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心，腫瘤系，腫瘤細(xì)胞采用10%胎牛血清培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱。培養(yǎng)基及胎牛血清由美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn)，試劑盒由Qiagen公司生產(chǎn)。

1.2.2試驗(yàn)方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)。組織和細(xì)胞置入700 μlQIAzol混勻，室溫5 min；加入140 μl氯仿，震蕩搖勻，室溫放置2 min后于12000r/min下離心15 min，取上清液，加入500 μl無(wú)水乙醇，混勻，10000r/min下離心15 s，去穿流液并再次重復(fù)該步驟，洗柱，取BufferRPE500 μl置于室溫下10000r/min下離心2 min，轉(zhuǎn)移至1.5 ml收集管，加入RNase-free water 50 μl至內(nèi)膜，震蕩搖勻，置于-70 ℃下保存。依次加入1ug total RNA，1 μl 10×reaction buffer，0.25 μl RiboLock Ribonuclease，0.25 μl Inhibitor，8 μl DEPC-treated water，1 μl DNase I，置于37 ℃下孵育30 min，加入1 μl EDTA并置于65 ℃下孵育10 min，添加至PCR管中，短暫離心混勻，95 ℃預(yù)變性5 min，擴(kuò)增40各Cycling，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s。取培養(yǎng)液加入96孔板，每孔100 μl，置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，加入受試化合物，采用Dilution Buffer稀釋1/5，每孔加入50 μl 1×MTT，37 ℃下孵育4 h，吸出上清液，每孔加入150 μl DMSO，搖勻，采用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm波長(zhǎng)時(shí)的每孔光密度，細(xì)胞存活率=(加藥細(xì)胞OD-本底OD/對(duì)照細(xì)胞OD-本底OD)×100%。消化細(xì)胞，離心，去培養(yǎng)液，PBS洗1～2次，采用BSA無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)密度為5×104ml。加入6孔板，加入1 mlFBS培養(yǎng)基，在Transwell上室加入細(xì)胞懸2 ml，常規(guī)培養(yǎng)24 h，95%酒精固定20 min，蘇木素染色10 min，200×電鏡下觀察隨機(jī)5各視野的計(jì)數(shù)。取1×107個(gè)細(xì)胞在4 ℃下離心5 min，吸去上清，PBS洗1次，取樣品細(xì)胞加入裂解液100 μl重懸，冰浴裂解15 min，4 ℃下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入離心管，取少量樣品測(cè)定蛋白濃度，繪制caspase-3酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-30b的表達(dá)膀胱癌細(xì)胞中的miR-30b表達(dá)為(1.096±0.449)，與癌旁組織的(8.617±1.856)比較，顯著降低(t=-6.822，P< 0.05)。

2.2臨床分期各組中miR-30b的表達(dá)本組患者包括II期19例，III～I(xiàn)V期13例，其中miR-30b在II期患者的癌癥組織中表達(dá)量為(1.092±0.437)，在III～I(xiàn)V期患者中表達(dá)量為(1.104±0.456)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

2.3病理分期各組中miR-30b的表達(dá)本組患者包括中低分化21例，高分化11例，miR-30b在中低分化患者中的表達(dá)量為(0.741±0.209)，在高分化患者中的表達(dá)量為(1.690±0.479)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.145，P< 0.05)。

2.4轉(zhuǎn)染效率采用綠色熒光標(biāo)記6 h，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞胞漿表達(dá)情況，評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示miR-30b的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上，證明本次轉(zhuǎn)染能夠有效將miR-30b轉(zhuǎn)染于T24腫瘤細(xì)胞。見圖1、圖2。

圖1 轉(zhuǎn)染目的miR-30b mimics組轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

圖2 陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

2.5miR-30b對(duì)癌細(xì)胞侵襲能力的的影響將Transwell小室置入培養(yǎng)板，用聚碳酸酯膜隔離上下室，將T24腫瘤細(xì)胞置入上室，統(tǒng)計(jì)進(jìn)入下室的T24數(shù)量，以此來(lái)評(píng)價(jià)癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-30b組T24細(xì)胞的侵襲數(shù)量為(19.43±2.06)，陰性對(duì)照組的侵染數(shù)量為(45.49±3.56)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-10.974，P< 0.05)。

2.6miR-30b對(duì)癌細(xì)胞凋亡的影響采用標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算各組中的caspase-3酶活性，陰性對(duì)照組酶活性為(15.437±1.594)U/mg，轉(zhuǎn)染miR-30b組的酶活性為(46.019±6.004)U/mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.527，P< 0.05)。

3 討論

膀胱癌屬于泌尿生殖系統(tǒng)的常見腫瘤，目前尚無(wú)特效治療方案，研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于預(yù)防、治療膀胱癌均有著重要的意義。既往的研究主要集中在膀胱癌細(xì)胞基因的改變上，但目前尚未有突破性進(jìn)展。目前已知與膀胱癌相關(guān)的基因型較多，Derfoul等[9]的研究指出bcl-2的異常表達(dá)是導(dǎo)致膀胱癌輻射治療效果降低的獨(dú)立因素；Catto等[10]的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌中C-myc蛋白的表達(dá)與癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力有顯著相關(guān)。

miRNA屬于一種小型非編碼RNA分組，這些小型的RNA實(shí)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，屬于更高層次上的調(diào)控。CNS將miNRA的研究進(jìn)展列為十大科技突破之一，肯定了miRNA在癌細(xì)胞機(jī)制研究中的意義[11]。腫瘤細(xì)胞與正常組織miRNA的表達(dá)存在顯著差異，且大多數(shù)miRNA都處于相對(duì)脆弱的基因位點(diǎn)上，這提示miRNA可能在腫瘤的行程中有著重要的作用。Feng等[12]對(duì)412個(gè)哺乳動(dòng)物的樣本中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，研究顯示miRNA的表達(dá)能提供多種有用信息，可以反映出腫瘤的分化狀態(tài)及發(fā)展譜系。Li等[13]對(duì)174例膀胱癌患者組織標(biāo)本和52例正常膀胱標(biāo)本進(jìn)行了miRNA檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)若干表達(dá)差異的miRNA，其中miR-145下調(diào)最為顯著，miR-21上調(diào)最為顯著，該研究指出miR-129、miR-133b等屬于具有預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展?jié)撃艿闹匾猰iRNA。本次研究中利用實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)對(duì)膀胱癌標(biāo)本和癌旁組織進(jìn)行了miR-30b的表達(dá)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-30b在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著低于正常組織，這提示miR-30b可能與膀胱癌的發(fā)生有所相關(guān)。

Nagaraja等[14]研究認(rèn)為不同分級(jí)的膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展途徑有所不同。有相關(guān)研究顯示，不同分級(jí)的膀胱癌的miRNA表達(dá)譜也存在顯著差異，例如miR-125b在肌層浸潤(rùn)性膀胱癌中的表達(dá)最高，而miR-10則在淺表性膀胱癌中的表達(dá)最高。從本次研究情況來(lái)看，miR-30b在不同臨床分期患者中的表達(dá)并無(wú)差異，考慮原因主要是本次選擇標(biāo)本均為浸潤(rùn)性膀胱癌。但從病理分級(jí)來(lái)看，miR-30b的表達(dá)與腫瘤組織的分化程度有所相關(guān)，高分化的癌癥組織中miR-30b的表達(dá)相對(duì)較高，中低分化組織中的表達(dá)則相對(duì)較低，提示miR-30b可能具有抑癌基因的特點(diǎn)。

研究表明[15，16]，miRNA能夠廣泛的參與到基因表達(dá)的各種生物學(xué)調(diào)控中，包括細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等。有研究表明[17]，miRNA是腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的重要因素，與腫瘤的轉(zhuǎn)歸也有密切相關(guān)，miRNA能夠參與到腫瘤細(xì)胞的周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、血管生成、浸潤(rùn)及凋亡等環(huán)節(jié)中，正常細(xì)胞與癌細(xì)胞中的多種miRNA表達(dá)均存在顯著差異，這說(shuō)明miRNA可能在腫瘤中扮演中癌基因或抑癌基因的角色。Goebell等[18]的報(bào)道指出，包括miR-221、miR-223、miR-23b、miR-26b在內(nèi)的多種miRNA均能夠在膀胱上皮癌中異常表達(dá)。Guertin等[19]的研究發(fā)現(xiàn)了miR-200家族，并指出miR-205在膀胱癌組織中的表達(dá)顯著降低。

細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的最基本特征。本次研究結(jié)果顯示，miR-30b在膀胱癌T24細(xì)胞中的增值速度與陰性對(duì)照組相比明顯降低，提示miR-30b能夠抑制T24細(xì)胞的增殖，發(fā)揮了抑癌基因的效果。

侵襲能力是導(dǎo)致癌性腫瘤患者死亡的重要因素，屬于一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)性過(guò)程。近年來(lái)的研究顯示miRNA的表達(dá)能夠影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性，Castedo等[20]的研究顯示miRNA200家族在未分化甲狀腺癌中的表達(dá)顯著低于高分化甲狀腺癌，推測(cè)此類miRNA的表達(dá)降低能夠促進(jìn)未分化甲狀腺癌的潛在侵襲性。從本次侵襲轉(zhuǎn)移研究來(lái)看，miR-30b轉(zhuǎn)染組的T24細(xì)胞的侵襲能力相較于陰性對(duì)照組而言明顯減弱，這提示miR-30b具有抑制膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的作用。

腫瘤細(xì)胞的凋亡與增殖功能相反，同樣決定著腫瘤的消長(zhǎng)能力。越來(lái)越多的研究顯示miRNA屬于調(diào)控癌癥細(xì)胞增殖和凋亡的重要因素。Hansel等[21]的研究顯示miR-21在乳腺癌組織中的表達(dá)顯著增高，利用抗腫瘤ASO片段抑制乳腺癌細(xì)胞miR-21的表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制，細(xì)胞的凋亡率增加，這個(gè)研究顯示miR-21的表達(dá)降低能夠促進(jìn)乳腺癌組織的凋亡。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中有著重要的作用，caspase通常以酶原形式存在，在正常組織和腫瘤組織中均有表達(dá)，一旦caspase被激活并執(zhí)行致命性切割指令，即會(huì)引起細(xì)胞的凋亡[22]。本次研究檢測(cè)T24癌細(xì)胞的凋亡即是基于caspase的特性，利用測(cè)定吸光度來(lái)檢測(cè)caspase-3的活性。本次研究顯示，miR-30b轉(zhuǎn)染組的凋亡率顯著高于陰性對(duì)照組，提示miR-30b的表達(dá)越低，細(xì)胞的凋亡率也就越低。

綜上所述，膀胱癌組織中的miR-30b表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，提示miR-30b的水平與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展有所相關(guān)，miR-30b的表達(dá)與臨床分期無(wú)關(guān)，但與病理分期顯著相關(guān)，miR-30b導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞后，能夠顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲能力，加速癌細(xì)胞的凋亡。