復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病106例菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)分析

劉九菊，楊文麗，張利革

（1.甘肅省平?jīng)鍪腥A亭縣婦幼保健院，甘肅平?jīng)?44100；2.甘肅省張掖市甘州區(qū)婦幼保健院，甘肅張掖734000）

外陰陰道假絲酵母菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）曾稱外陰陰道念珠菌病，是青春期至絕經(jīng)期前婦女最常見(jiàn)的下生殖道感染之一，多數(shù)婦女一生中至少患過(guò)一次VVC，部分經(jīng)歷過(guò)更多次發(fā)病。VVC 的病原體為假絲酵母菌，80%～90%是白假絲酵母菌，10%～20%為光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌等非白假絲酵母菌［1］。近些年隨著國(guó)內(nèi)唑類等抗真菌藥物、廣譜抗菌藥物、激素和免疫抑制劑在臨床上廣泛應(yīng)用和不規(guī)范使用，以及性傳播疾病、糖尿病等發(fā)病率逐年升高等因素，致病假絲酵母菌發(fā)生菌種變遷或耐藥，導(dǎo)致許多VVC患者病情反復(fù)發(fā)作，發(fā)展成復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌?。╮ecurrent vulvovagina candidiasis，RVVC）。RVVC是指VVC經(jīng)過(guò)治療，臨床癥狀和體征消失，真菌學(xué)檢查陰性后又出現(xiàn)癥狀，且真菌學(xué)檢查陽(yáng)性或在1年內(nèi)反復(fù)發(fā)作4次或4次以上［2］。RVVC的復(fù)發(fā)的因素較多，病因非常復(fù)雜，病情十分頑固，臨床診斷和治療很困難。筆者對(duì)106 例RVVC患者陰道分泌物進(jìn)行假絲酵母菌培養(yǎng)、菌株鑒定和藥敏分析，以了解病原菌的構(gòu)成及藥物敏感性的情況，為臨床診治和合理用藥提理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1月至2014年6月來(lái)于本院就診的RVVC患者106例，年齡22～48歲。臨床主要癥狀是外陰瘙癢和充血。

1.2 儀器與試劑 科瑪嘉（CHROMagar）假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基，藥敏平板：RPMI－1640 平板，抗真菌藥敏紙片：氟康唑（15μg／片），克霉唑（10μg／片），咪康唑（10μg／片），制霉菌素（50μg／片），質(zhì)控菌株：ATCC 90028白色假絲酵母菌，由溫州市康泰生物科技有限公司提供。酵母菌鑒定卡（API 20C AUX）購(gòu)于法國(guó)生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 囑患者近日停用抗真菌藥物，用窺陰器擴(kuò)張陰道，以無(wú)菌棉拭子取陰道后穹窿分泌物2份，1份涂片鏡檢，1份做培養(yǎng)，馬上保溫送檢。

1.3.2 涂片鏡檢 陰道分泌物滴加10%氫氧化鉀涂片，在10×40倍顯微鏡下觀察到圓形的芽生孢子或菌絲為假絲酵母菌陽(yáng)性。

1.3.3 培養(yǎng)鑒定 陰道分泌物直接連續(xù)劃線接種在科瑪嘉假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基，放置28 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48h后觀察生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)7d不生長(zhǎng)為陰性。依據(jù)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的假絲酵母菌菌落顏色差異和特征來(lái)進(jìn)行菌株鑒定。白色念珠菌呈翠綠色，直徑大約2 mm；熱帶念珠菌呈鐵藍(lán)色，直徑約1.5 mm；克柔氏念珠菌呈粉紅色，菌落較大，模糊有微毛，直徑4～5mm；光滑念珠菌呈紫色直徑約2mm，其他假絲酵母菌落呈白色。其他假絲酵母菌和顯色不確定的菌株經(jīng)純化后，用法國(guó)生物梅里埃API 20CCAX 鑒定卡完成。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 待測(cè)菌液濃度調(diào)成0.5麥?zhǔn)蠞岫?，克柔念珠菌再稀?倍。用無(wú)菌棉拭子沾取菌懸液，略擠壓，直接均勻涂布RPMI－1640平皿（直徑9cm），最后沿平皿周邊繞兩圈，平皿放35 ℃開(kāi)蓋倒扣干燥15min，待平板上的水分被瓊脂完全吸收后再貼紙片。每個(gè)平皿貼藥敏紙4個(gè)，紙片之間距離大于24mm，與培養(yǎng)基邊緣距離為15mm。放置于30～35 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h后測(cè)量抑菌圈直徑。參照廠家說(shuō)明書標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。質(zhì)控菌株：ATCC90028白色假絲酵母菌。

2 結(jié) 果

106例RVVC患者分泌物涂片染色陽(yáng)性為82份，陽(yáng)性率為77.4%，培養(yǎng)陽(yáng)性為96 份，陽(yáng)性率為89.6%，共分離出98株假絲酵母菌，有2例同時(shí)檢出2種假絲酵母菌。其中白色假絲酵母菌66株占67.4%，光滑假絲酵母菌14株占14.2%，熱帶念珠菌9株占9.2%，克柔假絲酵母菌4株占4.1%，其他假絲酵母菌5株占5.1%，見(jiàn)表1。98株假絲酵母菌抗真菌藥物的藥敏試驗(yàn)，對(duì)制霉菌素的敏感率最高（95.9%），其次是氟康唑（73.5%），克霉唑（62.3%）和咪康唑（53.0%）較低，見(jiàn)表2。

表1 98株假絲酵母菌分布情況（%）

表2 98株假絲酵母菌對(duì)4種抗真菌藥物的藥敏結(jié)果［n（%）］

3 討 論

假絲酵母菌又稱念珠菌，是人體正常菌群，多定植在口腔，腸道，生殖道和皮膚等部位。假絲酵母菌是條件致病菌，為雙相真菌。約10%～20%非妊娠婦女和30%妊娠婦女陰道中有假絲酵母菌寄生，一般帶菌量少，正常情況下呈酵母相不致病。只有在全身及陰道局部細(xì)胞免疫功能降低時(shí)，假絲酵母菌孢子大量繁殖，轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u力很強(qiáng)的菌絲相致病，引起癥狀。首先孢子黏附于宿主陰道上皮細(xì)胞，出芽并延長(zhǎng)形成菌絲，菌絲穿透陰道上皮細(xì)胞侵入組織吸收營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)分泌多種侵襲性酶和毒素，引起陰道組織炎癥反應(yīng)。假絲酵母菌菌體呈圓形或卵圓形，以出芽繁殖，稱芽生孢子。孢子伸長(zhǎng)成芽管，不與母菌體脫離，形成較長(zhǎng)的假菌絲。分泌物直接涂片在顯微鏡下可觀察到芽生孢子和假菌絲，是VVC診斷中常用且首選的方法。分泌物真菌培養(yǎng)在診斷中意義較大，但由于在無(wú)癥狀的陰道寄居時(shí)也可出現(xiàn)陽(yáng)性，因此培養(yǎng)并不常規(guī)應(yīng)用，只有在出現(xiàn)典型陰道炎的臨床癥狀，而顯微鏡檢查陰性或反復(fù)發(fā)作，以及懷疑耐藥菌株或非白色念珠菌感染時(shí)，采用培養(yǎng)方法可提高診斷的準(zhǔn)確性［3］。

近年來(lái)隨著RVVC 中非白假絲酵母菌分離率的不斷上升［4］，使得RVVC的診斷和治療更為復(fù)雜，并出現(xiàn)了對(duì)常用抗真菌藥物耐藥的現(xiàn)象。非白假絲酵母菌中以光滑假絲酵母菌最為常見(jiàn)，由于光滑假絲酵母菌只有酵母相而無(wú)菌絲相，不形成菌絲，涂片顯微鏡下只能看到孢子，很容易被漏診或誤診，必須依靠培養(yǎng)才能確診。光滑假絲酵母菌在堿性的環(huán)境的耐受力強(qiáng)于白色假絲酵母菌，常對(duì)咪唑類藥物耐藥，所以容易反復(fù)發(fā)作，遷延發(fā)展成RVVC。目前，直接涂片法已不能滿足臨床診治的需要，需要開(kāi)展分泌物假絲酵母菌的培養(yǎng)鑒定。傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)鑒定方法由于試驗(yàn)過(guò)程繁瑣，回報(bào)的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)等原因在基層醫(yī)院開(kāi)展較少。近年來(lái)新型的科瑪嘉顯色培養(yǎng)法，因操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速準(zhǔn)確，在國(guó)內(nèi)外臨床微生物室應(yīng)用越來(lái)越廣?？片敿渭俳z酵母菌顯色培養(yǎng)基對(duì)生殖道等標(biāo)本進(jìn)行初代培養(yǎng)，陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)的沙氏培養(yǎng)基（SDA），并且對(duì)混合感染區(qū)別能力更強(qiáng)［5－6］。筆者應(yīng)用科瑪嘉假絲酵母菌顯色法對(duì)106例RVVC 患者行陰道分泌物培養(yǎng)，陽(yáng)性96 份，陽(yáng)性率為89.6%，共分離出98株假絲酵母菌。其中白色假絲酵母菌66株占67.4%，優(yōu)勢(shì)已明顯下降，非白色假絲酵母菌分離率上升，達(dá)32株（32.6%），其中光滑假絲酵母菌14株占14.2%，熱帶念珠菌9株占9.2%，克柔假絲酵母菌4株占4.1%，其他假絲酵母菌5株占5.1%。與文獻(xiàn)［7］報(bào)道相近。98株假絲酵母菌對(duì)4種抗真菌藥物的敏感性如下，制霉菌素的敏感率最高（95.9%），其次是氟康唑（73.5%），而克霉唑（62.3%）和咪康唑（53.0%）較低，與這兩種唑類藥物在臨床廣泛使用和濫用誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥株有關(guān)。因?yàn)樵S多醫(yī)生在VVC 治療時(shí)多經(jīng)驗(yàn)性選用咪康唑和克霉唑，這兩種藥是非處方藥（OTC），患者容易自購(gòu)，長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)用藥和不規(guī)范用藥可誘導(dǎo)假絲酵母菌產(chǎn)生耐藥，同時(shí)篩選出對(duì)唑類藥物不敏感的光滑假絲酵母菌，造成其感染率上升。

因此，臨床治療RVVC必須規(guī)范化使用抗真菌藥物，常規(guī)開(kāi)展真菌培養(yǎng)鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，選取敏感的抗真菌藥物強(qiáng)化治療，要求足量和足療程，必要時(shí)聯(lián)合用藥［8－16］。在強(qiáng)化治療達(dá)到真菌學(xué)治愈后，給予鞏固治療至半年，目前應(yīng)用生態(tài)療法在抗真菌治療后予陰道內(nèi)補(bǔ)充乳桿菌活菌制劑，恢復(fù)乳桿菌優(yōu)勢(shì)，能有效地阻抑假絲酵母菌的生長(zhǎng)和菌絲相的形成，進(jìn)一步鞏固治療效果［17］。其次，強(qiáng)調(diào)患者堅(jiān)持在治療結(jié)束后的定期的隨訪檢查，建議在3個(gè)月及6個(gè)月時(shí)進(jìn)行真菌培養(yǎng)。從而減少RVVC的發(fā)生，避免假絲酵母菌耐藥性產(chǎn)生。

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