銀杏葉提取物對家兔高膽固醇血癥模型腦組織形態(tài)學的影響*

高　青，馬東明，胡先同，盧　斌，張瑞峰，馮玉陶，姜希娟（.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津009；.新泰市中醫(yī)院病理科，新泰700；.天津武警后勤學院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，天津006）

銀杏葉提取物對家兔高膽固醇血癥模型腦組織形態(tài)學的影響*

高青1，馬東明1，胡先同1，盧斌1，張瑞峰2，馮玉陶3，姜希娟1
（1.天津中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，天津300193；2.新泰市中醫(yī)院病理科，新泰271200；3.天津武警后勤學院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，天津300162）

［目的］通過高膽固醇血癥家兔模型觀察銀杏葉提取物（EGB761）對中樞神經纖維的影響。［方法］以成年雄性新西蘭大白兔復制高膽固醇血癥模型，實驗分為4組：對照組、模型組、陽性藥辛伐他汀組、EGB761組。用蘇木精-伊紅（HE）染色和嗜銀染色法觀察神經元及神經纖維的形態(tài)學改變。［結果］外周膽固醇升高時，模型組海馬出現(xiàn)較多神經元變性、壞死，神經纖維纏結等病理改變。EGB761組變性、壞死的神經元明顯少于模型組，細胞核形態(tài)基本規(guī)則，嗜神經現(xiàn)象少見，神經纖維纏結少于模型組。［結論］EGB761可有效保護高膽固醇血癥時神經纖維結構的完整性。

銀杏葉提取物；高膽固醇血癥；神經纖維

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.09

傳統(tǒng)觀點認為血液中的膽固醇不能穿過血腦屏障，因此無法影響腦膽固醇的含量。近來研究表明高膽固醇飲食與阿爾茲海默癥（AD）有密切關系，高膽固醇血癥的個體具有更高的AD易感性［1］。AD是一種以記憶障礙為主，并伴有其他認知和精神行為異常為臨床表現(xiàn)的的疾病，是人類最常見的神經退行性疾病，病變部位主要在大腦皮質及海馬區(qū)域。銀杏葉作為防治神經退行性疾病的主要藥物，可以有效降低外周膽固醇水平大量臨床觀察發(fā)現(xiàn)銀杏內酯B對AD療效確切，前期研究表明它對離體高膽固醇損傷海馬神經元存在明確保護作用，同時可以降低神經元內膽固醇水平，干預神經元膽固醇代謝［2-3］。本實驗通過復制新西蘭兔高膽固醇血癥模型，進行蘇木精-伊紅（HE）染色及Glees銀染，觀察高膽固醇血癥對皮質及海馬的形態(tài)學影響及銀杏葉提取物（EGB761）的干預作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物選擇健康成年雄性新西蘭大白兔共39只，體質量為（2 356±212）g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1復制高膽固醇血癥動物模型所有家兔均給予普通飼料和自來水適應喂養(yǎng)2周，飼養(yǎng)條件為溫度（28±2）℃，濕度為37%～48%。2周之后，從中隨機取出9只作為對照組，仍然飼以普通飼料及蒸餾水，直到實驗結束，共需9周。其余30只家兔均采用D.Larry Sparks［4］的造模方法進行高膽固醇血癥家兔的造模，即用2%的高膽固醇飼料喂養(yǎng)。高膽固醇飼料的配比為：4%的膽固醇、4%的花生油、92%的基礎飼料。具體飼養(yǎng)方法如下：因家兔不喜進食高膽固醇飼料，故每日早晨每只家兔均先飼以50 g高膽固醇飼料，待其全部吃完后再飼以50 g的普通飼料，飲水用蒸餾水。6周之后，通過家兔耳緣靜脈空腹取血，通過測定其血清總膽固醇的含量來驗證造模是否成功。

1.2.2篩選動物模型高膽固醇飼料喂養(yǎng)的30只家兔在6周后通過耳緣靜脈空腹取血，用半自動生化分析儀測定血清總膽固醇的含量。血清總膽固醇若高于1 400 mg/dL，則提示高膽固醇血癥模型復制成功，同時淘汰血脂未達到1 400 mg/dL的家兔。

1.2.3實驗分組及給藥方法正常對照組之外的30只家兔造模成功28只，淘汰2只，將28只造模成功的家兔按隨機數(shù)字表法隨機分為3組，即模型組（n=9）、陽性藥辛伐他汀組（n=8）、EGB761組（n= 11）。之后模型組和EGB761組又因高膽固醇血癥導致腦部疾患各死亡1只，因此最終模型組（8只）、陽性藥辛伐他汀組（8只）、EGB761組（10只）。模型組在6周后繼續(xù)給予高膽固醇飼養(yǎng)3周（由于停用膽固醇飼料后，家兔血膽固醇水平會很快降低，故須繼續(xù)給予高膽固醇飼料）。陽性藥辛伐他汀組給予辛伐他汀每日5mg/kg灌胃3周，其余處理同模型組。EGB761組每日給予EGB761 50 mg/kg灌胃3周，其余處理同模型組。以上各組飲水仍用蒸餾水，上述藥物劑量是按照成人體表面積折算的等效劑量。

1.2.4標本處理所有干預結束后，用生理鹽水配置濃度為3%的戊巴比妥鈉，經家兔耳緣靜脈注射給藥，待麻醉后將家兔固定于兔臺之上。然后開胸，打開左心室，將輸液器插入主動脈并用細線固定。剪開右心耳，用大量生理鹽水灌流，將血液洗凈。用骨鉗開顱取腦，取出腦后，用鑷子輕輕分離出海馬和皮質，皮質要去掉白質和腦膜。然后將取出的一側海馬和皮質浸入10%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，進行HE染色及Glees銀染。

2　結果

2.1腦組織HE染色組織形態(tài)學觀察正常對照組皮質及海馬HE染色鏡下顯示：細胞核呈藍色或深藍色，細胞漿及其他組織呈粉紅色。神經細胞排列緊密、整齊。細胞核形態(tài)規(guī)則，未見明顯核固縮、腫脹等病理改變。模型組出現(xiàn)較多的細胞核消失，神經元變性、壞死、減少，且有嗜神經現(xiàn)象。銀杏葉提取物EGB761組變性、壞死的神經元明顯少于模型組，細胞核形態(tài)基本規(guī)則，嗜神經現(xiàn)象少見。辛伐他汀組的情況與銀杏葉提取物EGB761組類似。見圖1。

圖1　HE染色結果Fig.1HE staining results

2.2腦組織Glees染色組織形態(tài)學觀察鏡下顯示：正常對照組皮質及海馬在黃色背景下，神經元軸突及神經纖維呈黑色，無神經元纖維聚集纏結等病理改變。模型組則出現(xiàn)較多神經元纖維聚集纏結的現(xiàn)象。銀杏葉提取物EGB761組神經元纖維聚集纏結的現(xiàn)象少于模型組而多于正常對照組。辛伐他汀組的情況與銀杏葉提取物EGB761組類似。見圖2。

圖2　Glees染色結果Fig.2　Glees staining results

3　討論

外周膽固醇不能通過血腦屏障，對腦膽固醇含量無直接影響［5］。腦內膽固醇通過CYP-46代謝途徑、載脂蛋白E結合途徑、ATP結合盒轉運體A1、類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白、膽固醇?；D移酶等轉運途徑維持平衡。腦膽固醇穩(wěn)態(tài)的破壞將誘發(fā)多種神經系統(tǒng)疾?。?］。本實驗結果顯示高膽固醇血癥可導致神經元的變性、壞死，出現(xiàn)嗜神經現(xiàn)象及較多神經元纖維聚集纏結的現(xiàn)象。表明外周膽固醇通過一定的機制破壞了神經纖維的正常組織結構。EGB761是中藥銀杏葉提取物標準制劑，具有調節(jié)血脂的功效，并可有效降低海馬部位的血腦屏障的完整性［7-9］。通過銀杏葉EGB761的干預后神經元變性、壞死明顯減少，嗜神經現(xiàn)象及神經元纖維聚集纏結現(xiàn)象少見，與辛伐他汀組類似。表明EGB761有效保護了高膽固醇血癥時神經纖維結構的完整性，具體機制有待進一步闡明。

［1］孫雯雯，頡賓芳，劉卉，等.高膽固醇血癥在阿爾茲海默病發(fā)生中的作用及藏藥柳茶提取物的治療效應［J］.中藥材，2012，35 （4）:569-602.

［2］姜希娟，盧斌，楊琳，等.銀杏內酯B對膽固醇和載脂蛋白E4損傷海馬神經元活性和生長的影響［J］.中國老年學雜志，2007，23（3）:203-205.

［3］姜希娟，杜云，楊琳，等.銀杏內酯B對膽固醇和載脂蛋白E4損傷海馬神經元凋亡的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2007，34（3）: 371-373.

［4］Sparks DL，Kuo YM，Roher A，et al.Alterations of Alzheimer’s disease in the cholester-fed rabbit，including vascular inflammation［J］. Preliminary observations Ann N Y Acad Sci，2000，903:335-441.

［5］Griffiths WJ，Wang Y.Analysis of oxysterol metabolomes［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1811（11）:784-799.

［6］和欣，郭振宇，孫紅梅，等.膽固醇代謝異常與神經系統(tǒng)疾病關系的研究進展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，112（36）:7179-7181.

［7］馬東明，張瑞峰，王強，等.銀杏葉提取物EGB761對高膽固醇家兔肝質量和形態(tài)的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2009，26（6）:493-494.

［8］王強，姜希娟，范英昌，等.銀杏葉提取物EGB761對高膽固醇血癥家兔血腦屏障通透性的影響［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2010，27 （1）:30-32.

［9］姜希娟，盧斌，馬東明，等.銀杏葉提取物EGB761對阿爾茨海默病家兔模型ACAT1和LCAT mRNA表達的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（1）:59-60.

（本文編輯：馬英，馬曉輝）

Effect of the extract of Ginkgo Biloba in brain tissue morphology in rabbit hypercholesteremia model

GAO Qing1，MA Dong-ming1，HU Xian-tong1，LU Bin1，ZHANG Rui-feng2，F(xiàn)ENG Yu-tao3，JIANG Xi-juan1
（1.School of Integrative Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Department of Pathology，Xintai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xintai 271200，China；3.Department of Traditional Chinese Medicine，Affiliated Hospital of Tianjin Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China）

［Objective］To study the effect of the extract of Ginkgo Biloba 761（EGB 761）on brain tissue morphology in rabbit hypercholesteremia model.［Methods］We built the hypercholesteremia model with male New Zealand white rabbits，which were divided into four groups:the control group，the model group，the simvastatin group，the EGB761 group.Detecting the morphology change of nerve fiber with HE staining and silver staining.［Results］The hippocampus in model group showed neuronal degeneration，necrosis and microfibers tangles while the EGB761 group showed less neuronal degeneration，necrosis and microfibers tangles，and regular nuclear morphometry. ［Conclusion］EGB761 can effectively protect the integrity of the structure of nerve fibers in hypercholesterolemia.

extract of Ginkgo Biloba；hypercholesteremia；nerve fiber

R285.5

A

1672-1519（2015）03-0165-03

*資金項目：高校博士點專項基金資助項目（20101210120008）。

高青（1988-），女，碩士研究生，主要從事干細胞及心血管疾病方面的研究。

姜希娟，E-mail:xijuanjiang@foxmail.com。

（2014-11-03）