不同頻率提插水溝穴對大鼠局灶性腦缺血再灌注皮質細胞凋亡及NF-κB p65、Caspase-3的影響*

沈　燕，王　永，李　卓，林海平，陳英英，王　舒（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法研究室，國家中醫(yī)藥管理局針刺量效關系三級實驗室，天津市針灸學重點實驗室，天津300193）

·實驗研究·

不同頻率提插水溝穴對大鼠局灶性腦缺血再灌注皮質細胞凋亡及NF-κB p65、Caspase-3的影響*

沈燕，王永，李卓，林海平，陳英英，王舒
（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，國家中醫(yī)藥管理局腦病針刺療法研究室，國家中醫(yī)藥管理局針刺量效關系三級實驗室，天津市針灸學重點實驗室，天津300193）

［目的］研究不同頻率提插水溝穴對大鼠局灶性腦缺血再灌注皮質缺血區(qū)NF-κB p65和Caspase-3的影響，尋求適宜針刺頻率。［方法］將成年Wistar雄性大鼠隨機分為空白組、假手術組、模型組、水溝穴低頻提插組、水溝穴中頻提插組、水溝穴高頻提插組，每組大鼠6只?？瞻捉M不造模，假手術組造模時在頸內(nèi)動脈內(nèi)不插入線栓，其余4組均完成局灶性腦缺血再灌注模型。空白組、假手術組和模型組均常規(guī)飼養(yǎng)，不進行針刺干預；水溝穴低頻提插組、水溝穴中頻提插組、水溝穴高頻提插組均進行對應頻率的針刺干預。每日兩次，針刺3 d。TUNEL法檢測各組大鼠皮質細胞凋亡的表達，免疫熒光檢測大腦皮質NF-κB p65和Caspase-3的表達。［結果］皮質細胞凋亡的表達：各針刺組與模型組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，針刺低頻組和針刺中頻組及高頻組差異有均統(tǒng)計學意義（P＜0.01及P＜0.05），針刺中頻組和高頻組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05））。大腦皮質NF-κB p65和Caspase-3的表達：各針刺組與模型組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，針刺低頻組和高頻組有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），針刺中頻組和高頻組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。［結論］針刺各個頻率組都可顯著降低腦缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡，其中針刺中頻組和高頻組要顯著優(yōu)于低頻組，其可能與降低皮質細胞NF-κB p65和Caspase-3的表達量有關。

針刺；穴；水溝；局灶性腦缺血再灌注；刺激參數(shù)/針刺效應

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.03.08

腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復發(fā)率的特點，嚴重危害人類的健康。腦組織細胞缺血以后，機體通過產(chǎn)生一系列復雜的病理生理變化，氧化應激反應，炎癥細胞浸潤，炎癥因子進一步活化釋放，加重腦組織損傷。大量研究證實，針刺對腦缺血損傷有明確的治療作用。頻率是針刺手法效應的兩個最重要的刺激參數(shù)因素之一，本研究擬觀察不同頻率提插對大鼠局灶性腦缺血再灌注大腦皮質NF-κB p65和Caspase-3表達量的影響，以探討適宜的針刺提插頻率，為臨床針刺手法標準化提供更多的實驗依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗動物及分組實驗選用健康成年Wistar雄性大鼠，體質量為200～250 g，由中國軍事醫(yī)學醫(yī)學科學院實驗動物中心提供（SPF級）。按照隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、假手術組、模型組，每組6只，針刺組18只。實驗動物于二級動物房飼養(yǎng)，室溫（20～25℃），光照時間（07∶00～19∶00）自由攝食、飲水。針刺實驗結束后，進行神經(jīng)功能評分，針刺組再隨機分為水溝穴低頻提插組，水溝穴中頻提插組、水溝穴高頻提插組，每組各6只大鼠。手術和實驗過程經(jīng)天津中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，所有動物實驗均遵守相關規(guī)定進行處理。

1.2實驗方法

1.2.1干預方法針刺組：大鼠水溝穴定位參照《實驗針灸學》穴位標準。針具選用蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)的“華佗牌”毫針，長4 cm，直徑0.30 mm，水溝組大鼠朝向鼻中隔方向針刺2 mm。水溝穴各參數(shù)組于造模成功后開始針刺，提插操作頻率分別為低頻1次/秒、中頻2次/秒，高頻3次/秒。提插深度2 mm，針刺時間為60 s，每日2次，共3 d。其余各組均不實施針刺治療。為保證針刺頻率、深度、操作時間的可控性與穩(wěn)定性，避免人工操作的誤差，提插刺法操作由重慶海扶技術有限公司研制的針刺機械手完成。

模型組和假手術組：造模成功后相應時間段內(nèi)，用與針刺組實施同等條件的抓取，但不實施任何針刺干預，72 h共抓取6次。

空白組：不造模型，與針刺組實施同等條件的抓取，但不實施任何針刺干預，72 h共抓取6次。

1.2.2大鼠局灶性腦缺血再灌注模型制作1）參照Zea Longa［1］線栓法加以改進制作大腦中動脈缺血再灌注模型（MCAO/R）。術前12 h對大鼠禁食，6 h禁水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg體質量）。將大鼠仰臥位固定，線栓從頸外動脈至頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈，線栓深入顱內(nèi)約18～20 mm。阻斷2 h后，撥出線栓，完成缺血再灌注模型。假手術組除不插線栓外其余步驟同模型組和針刺組，正常組不做任何處理。2）神經(jīng)功能評分具體采用Zausinger 6分法［2］：去除評分為0分、4分、5分及死亡的動物。3）整個造模過程中（正常組及假手術組除外）使用激光多普勒血流儀對大鼠腦血流進行實時監(jiān)測，以線栓插入之前的腦血流值為基線，插入線栓后其腦血流值下降到基線的15%～30%，拔出線栓實現(xiàn)再灌注后腦血流有所恢復，則符合腦缺血及再灌注的腦血流要求。

1.2.3組織石蠟切片制備各組大鼠分別于再灌注72 h再次麻醉，經(jīng)含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）灌注液心臟灌注固定后，取腦，以視交叉和其后4 mm處兩點冠狀切片，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切成4 μm厚的連續(xù)冠狀石蠟切片備用。

1.2.4TUNEL凋亡細胞檢測采用羅氏In site cell death detection kit（FITC）進行凋亡細胞檢測，依照說明書依次將石蠟切片進行常規(guī)脫蠟和梯度酒精水化后，蛋白酶K溶液，室溫孵育20 min，TdT平衡緩沖液，室溫孵育10～30 min，含有FITC-12-dUTP標記混合物的TdT孵育緩沖液，37℃孵育60 min，最后PBS漂洗終止反映，甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，每張切片取皮層缺血區(qū)5個不重復視野進行陽性細胞計數(shù)。

1.2.5免疫熒光染色石蠟切片進行常規(guī)脫蠟和梯度乙醇水化后，用枸櫞酸修復液在微波爐中進行抗原修復；之后進行血清封閉（北京中衫封閉液）；滴加適宜濃度的一抗（santacruz；1∶200）置濕盒中4℃孵育過夜；滴加熒光二抗（santacruz）室溫置濕盒中避光孵育1 h，用PBS 3 min×3次洗去二抗，用濾紙擦去標本外的PBS。最后用含甘油封片，并在熒光顯微鏡下立即觀察。每只大鼠取1張石蠟切片，每張切片取皮質缺血區(qū)5個不同視野拍照后進行陽性細胞計數(shù)。

1.3統(tǒng)計學方法應用SPSS 18.0進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差

2　結果

2.1TUNEL法檢測各組大鼠皮質細胞凋亡的表達結果顯示：空白組及假手術組少有細胞凋亡的表達，而模型組則有大量的凋亡細胞表達，通過針刺治療后則發(fā)現(xiàn)凋亡細胞數(shù)量明顯減少。對各組大鼠皮質的細胞凋亡進行統(tǒng)計分析：模型組與空白組、假手術組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，模型組大鼠大腦皮質的細胞凋亡數(shù)量明顯多于空白組和假手術組；各針刺組與模型組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，針刺組治療后大鼠大腦皮質的細胞凋亡數(shù)量比模型組大鼠明顯減少；水溝低頻組和水溝中頻組，以及高頻組均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01或P＜0.05），水溝中頻組和高頻組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表1。

表1　各組大鼠皮質細胞凋亡的陽性表達比較Tab.1　Comparison of positive expression of cortical cell apoptosis of rats in each group

表1　各組大鼠皮質細胞凋亡的陽性表達比較Tab.1　Comparison of positive expression of cortical cell apoptosis of rats in each group

注：與空白組及假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與水溝低頻組比較，△P＜0.05。

組別n陽性細胞空白組61.13±0.24假手術組64.43±1.42模型組674.37±2.45*水溝低頻組648.63±4.37#水溝中頻組636.20±2.79#△水溝高頻組634.77±5.62#△

2.2免疫組化檢測大腦皮質NF-κB p65的陽性表達實驗結果顯示，模型組與空白組、假手術組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，模型組大鼠大腦皮質細胞NF-κB p65的陽性表達量明顯多于空白組和假手術組；各針刺組與模型組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，針刺組治療后大鼠大腦皮質的細胞凋亡數(shù)量比模型組大鼠明顯減少；水溝低頻組和高頻組有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），水溝中頻組和高頻組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

表2　各組大鼠皮質細胞p65的陽性表達比較Tab.2　Comparison of positive expression of p65 cerebral cortex of rats in each group

表2　各組大鼠皮質細胞p65的陽性表達比較Tab.2　Comparison of positive expression of p65 cerebral cortex of rats in each group

注：與空白組及假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與水溝低頻組比較，△P＜0.01。

組別nP65陽性細胞表達量空白組617.33±2.74假手術組613.53±3.08模型組665.97±3.38*水溝低頻組648.93±4.85#水溝中頻組643.10±6.16#水溝高頻組637.87±3.65#△

2.3免疫組化檢測大腦皮質Caspase-3的陽性表達實驗結果顯示，模型組與空白組、假手術組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，模型組大鼠大腦皮質細胞Caspase-3的陽性表達量明顯多于空白組和假手術組；各針刺組與模型組比較（P＜0.01）有統(tǒng)計學差異，針刺組治療后大鼠大腦皮質的細胞凋亡數(shù)量比模型組大鼠明顯減少；水溝低頻組和高頻組有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），水溝中頻組和高頻組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表3。

表3　各組大鼠皮質細胞Caspase-3的陽性表達比較Tab.3　Comparison of positive expression of Caspase-3 cerebral cortex of rats in each group

表3　各組大鼠皮質細胞Caspase-3的陽性表達比較Tab.3　Comparison of positive expression of Caspase-3 cerebral cortex of rats in each group

注：與空白組及假手術組比較，*P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01；與水溝低頻組比較，△P＜0.01。

組別nCaspase-3陽性細胞表達量空白組611.97±4.84假手術組616.00±4.40模型組668.27±3.79*水溝低頻組644.57±5.52#水溝中頻組640.23±3.13#水溝高頻組638.13±2.21#△

3　討論

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血一定時間再恢復血液供應后，大腦功能不僅沒有得到及時恢復，反而出現(xiàn)更加嚴重的功能活動障礙。缺血再灌注損傷是一種常見、復雜的病理生理過程，其主要的損傷形式是細胞凋亡。NF-κB參與多種趨化因子、炎性細胞因子和成纖維細胞因子的合成，是介導細胞增殖分化、炎癥反應和誘導細胞凋亡的關鍵性轉錄因子。NF-κB與腦缺血再灌注損傷關系密切［4-6］，NF-κB調(diào)控著腦缺血再灌注損傷中一些黏附分子和細胞因子的表達，主要由p50和p65兩個亞基組成。

Caspase家族是一大類凋亡調(diào)控因子，Caspase-3 是Caspase級聯(lián)“瀑布下游”最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，其在正常細胞（包括神經(jīng)細胞）中以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，參與腦缺血再灌注后神經(jīng)元損傷的病理過程，引起細胞凋亡。研究證明Caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用［7］，是細胞凋亡的重要執(zhí)行者和哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，被稱作是“殺手蛋白”。近年來國內(nèi)外很多學者［2，8］都通過實驗證實：大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3表達明顯增強，凋亡細胞明顯增加，兩者之間存在明顯的時空相關性。

醒腦開竅針刺法治療中風病療效顯著［9-10］，水溝穴是“醒腦開竅”針刺法的主穴，系督脈穴，為手、足陽明經(jīng)與督脈的交會穴，可調(diào)督脈、開竅啟閉，醒腦開竅寧神。許多研究表明［11-13］，針刺水溝穴可改善腦循環(huán)，可促進側支循環(huán)建立，抑制腦神經(jīng)細胞凋亡。提插是行針的基本手法之一，提插的頻率是針刺手法量學中的重要內(nèi)容，提插的快慢的不同會導致針刺的效果不同?！鹅`樞·九針十二原》又云:“刺之害，中而不去則精瀉，不中而去則致氣?！本该麽樀拇碳ち恐杏嗪筒蛔?，不僅影響療效，而且會給患者帶來不良后果［14］。手法量學的研究就顯得尤為重要。本課題組以往的針刺水溝穴的針刺時間因素研究中，顯示對水溝施以5、60、180 s針刺時間，均有明顯改善大腦中動脈缺血模型大鼠行為學的趨勢，且優(yōu)于非穴組，顯示了水溝穴效應的特異性［15］。

本實驗結果顯示，皮質細胞凋亡陽性細胞比較，模型組與空白組和假手術組比較有顯著統(tǒng)計學意義，說明腦缺血再灌注后，模型組出現(xiàn)大量細胞凋亡。各針刺組與模型組比較有顯著統(tǒng)計學意義，針刺組治療后大鼠大腦皮質的細胞凋亡數(shù)量比模型組大鼠明顯減少，說明針刺治療效果明顯，水溝低頻組和水溝中頻組及高頻組均有統(tǒng)計學差異，水溝中頻組和高頻組比較無顯著性差異，說明水溝中頻組和高頻組效果優(yōu)于針刺低頻組。免疫熒光檢測大腦皮質Caspase-3和NF-κB p65的陽性表達，模型組與空白組和假手術組比較有顯著統(tǒng)計學意義，說明腦缺血再灌注后，模型組大腦皮質Caspase-3 和NF-κB p65陽性表達含量較正常組大幅度升高；各針刺組與模型組比較有顯著統(tǒng)計學差異，針刺組治療后大鼠大腦皮質的Caspase-3和NF-κB p65陽性表達量比模型組大鼠明顯減少。水溝低頻組和高頻組有統(tǒng)計學差異，水溝中頻組和高頻組比較無顯著性差異，說明水溝中頻組和水溝高頻組效果優(yōu)于針刺低頻組。

根據(jù)以上結果可以初步分析，在腦缺血再灌注發(fā)生后，某些物質可能激活了NF-κB p65，誘導NF-κB p65參與炎癥反應和神經(jīng)元凋亡途徑，進而激活相關信號通路，最終導致Caspase-3陽性表達增高，引起神經(jīng)元損傷，而針刺可能通過對上述過程某些中間產(chǎn)物的調(diào)控，下調(diào)NF-κB p65及Caspase-3陽性表達，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。針刺各個頻率組都可顯著降低腦缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡，其中水溝中頻組和高頻組要顯著優(yōu)于低頻組，其可能與降低大腦皮質細胞NF-κB p65和Caspase-3的表達量有關，中頻組和高頻組的比較優(yōu)勢還有待后續(xù)實驗進一步證實。

［1］EZ Longa，PR Weinstein，S Carlson，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）:84-91.

［2］Zhou HP，Wang MS，Shi F，et al.Effects of acupuncture preconditioningonapoptosisinhippocampalneuronsfollowing ischemia-reperfusion injury in aged rats［J］.Zhong Hua Yi Xue Za Zhi，2011，91（17）:1203-1206.

［3］Zausinger S，Hungerhuber E，Baethmann A，et al.Neurological impairment in rats after transient middle cerebral artery occlusion:a comparative study under various treatment paradigms［J］.Brain Res， 2000，863:94-105.

［4］Carroll JE，Howard EF，Hess DC，et al.Nuclear factor-kBactivation duringcerebralreperfusion：effectofattenuationwithN-acetylcysteine treatment［J］.Brain Res Mol Brain Res，1998，56（1-2）: 186-191.

［5］Zhang W，Potrovita I，Tarabin V，et al.Neuronal activation of NF-kappaB contributes to cell death in cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2005，25（1）:30-40.

［6］Clemens JA，Stephenson DT，Yin T，et al.Drug-induced neuroprotection fromglobal ischemia is associated with prevention of persistentbutnottransientactivationofNuclearFactor-κBinRats［J］. Stroke，1998，29:677-682.

［7］Broughton BR，Reutens DC，Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia［J］.Stroke，2009，40（5）:331-339.

［8］Ferrer I，F(xiàn)riguls B，Dalf O，et al.Caspase-dependent and caspaseindependent signaling of apoptosis in the penumbra following middle cerebrsl artery occlusion in the adult rat［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，2003，29（5）:472-481.

［9］石學敏，趙曉峰，熊杰，等.醒腦開竅針刺治療急性腦梗死臨床療效評價及蛋白質組學研究［J］.天津中醫(yī)藥，2006，23（5）：440.

［10］賀軍.針刺治療缺血性腦梗死后遺癥期180例的隨機對照臨床試驗［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（4）：295-297.

［11］郁潔，章薇，郭衛(wèi)軍.電針人中穴對大腦中動脈阻塞大鼠腦神經(jīng)細胞凋亡及其相關基因表達的干預［J］.中國臨床康復，2006，10（31）:90-92.

［12］孟智宏，杜元灝，石學敏.腦梗死大鼠腦、肺組織及血液中能量代謝指標變化及針刺的干預作用［J］.中國臨床康復，2005，9（45）: 96-98.

［13］李桂平，石磊，杜元灝，等.腦梗死早期側支循環(huán)重建及電針干預效應研究［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2011，30（2）：102-104.

［14］錢聚義.淺論《內(nèi)經(jīng)》中針刺補瀉的量學標準［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，1998，17（3）：7.

［15］張亞男，楊沙，樊小農(nóng)，等.穴位及針刺持續(xù)時間對針刺效應影響的實驗研究［J］.天津中醫(yī)藥，2010，27（2）：118-120.

（本文編輯：馬英，馬曉輝）

Effect of acupuncture on GV26 with lift-thrusting manipulation of different frequencies specifically regulating the expression of cortical cell apoptosis，NF-κB p65 and Caspase-3

SHEN Yan，WANG Yong，LI Zhuo，LIN Haiping，CHEN Ying-ying，WANG Shu
（Acupuncture Research Institute of The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Encephalopathy Acupuncture，The Third Level Laboratory of Acupuncture Dose-effect relationship of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Acupuncture and Moxibustion，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe effect of different acupuncture frequencies on NF-κB p65 and Caspase-3 of cerebral cortex region in Focal cerebral ischemia-reperfusion rats，so as to explore the appropriate frequency.［Methods］The 36 male Wistar rats were randomized into 6 groups:control group，false surgery group，model group，Shuigou（GV 26）with low frequency lifting-inserting manipulation（GV26-LOW）group，GV 26 with mid frequency lifting-inserting manipulation（GV26-MID）group and GV 26 with high frequency lifting-inserting manipulation（GV26-HIGH）group.The control group was not subjected to modeling，the false surgery group was operated as modeling groups but without procedure of inserting thread embolism into internal carotid artery，comparatively，the other four modeling groups were all completed the focal cerebral ischemia-reperfusion procedures.Rats in control group，false surgery group and model group were fedroutinely without acupuncture treatment；while，rats in GV26-LOW group，GV26-MID group，and GV26-HIGH group were all acupunctured on GV26 with corresponding methods twice a day for three days.Expression of cortical cell apoptosis was detected by TUNEL method and expression of NF-κB p65 and Caspase-3 in cerebral cortex by immunohistochemistry.［Results］Expression of cortical cell apoptosis in 3 acupuncture groups were significantly lower than that in model group（P＜0.01），moreover，its expression in GV26-MID group and GV26-HIGH group were significantly lower than that in GV26-LOW group（P＜0.01 or P＜0.05）.While，there was no statistical difference in cortical cell apoptosis expression between GV26-HIGH group and GV26-MID group（P＞0.05）.Expression of cortical NF-κB p65 and Caspase-3 in 3 acupuncture groups were significantly lower than that in model group（P＜0.01），moreover，its expression GV26-HIGH group were significantly lower than that in GV26-LOW group（P＜0.01）.While，there was no statistical difference in cortical NF-κB p65 and Caspase-3 between GV26-HIGH group and GV26-MID group（P＞0.05）.［Conclusion］Acupuncture with 3 different manipulation frequencies could significantly reduce the apoptosis caused by cerebral ischemia-reperfusion，while acupuncture with mid frequency and high frequency is superior to acupuncture with low frequency in the management of cerebral ischemia-reperfusion damage，which may be regulated by expression of NF-κB p65 and Caspase-3 in cerebral cortex.

acupuncture；acupoint；Shuigou；focal cerebral ischemia-reperfusion；stimulus parameter/acupuncture effect

R338.25

A

1672-1519（2015）03-0160-05

國家自然科學基金資助項目（81173339）；天津市應用基礎及前沿技術研究計劃重點項目（11JCZDJC19800）；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃。

沈燕（1978-），女，主治醫(yī)師，主要研究方向為針刺治療腦血管病及偏頭痛的臨床及基礎研究。

王舒，E-mail:wangs2008@163.com。

（2014-10-20）