香芍膠囊揮發(fā)油中桉油精的HPLC含量測定方法研究

張 林 朱麗萍 張愛軍

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041

香芍膠囊方中的川芎、香附、豆蔻等6味藥含有藥用揮發(fā)油，其中豆蔻揮發(fā)油含桉油精且豆蔻用量較大。桉油精作為處方中揮發(fā)油的有效成分，提取中對桉油精的合理控制，在一定程度上間接控制了揮發(fā)油的質(zhì)量。但桉油精屬于小分子揮發(fā)性化合物，有關(guān)桉油精的含量測定大多采用GC法，但色譜條件差異較大[1-12]。HPLC有更好的普適性[13]，HPLC法也應(yīng)用于多種揮發(fā)性成分的含量測定[14-15]。故擬建立HPLC法測定桉油精含量，為控制香芍膠囊揮發(fā)油質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與材料

AUW200D分析天平（日本島津SHIMADZU），高效液相色譜分析儀（Agilent 1200 series），桉油精對照品（中國食品藥品檢定研究院，110788-201105，99.9%），所用藥材由揚子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司提供并鑒定，均符合藥典規(guī)定；除乙腈為色譜純，其余所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

取處方中6味含有藥用揮發(fā)油藥材，加5倍于藥材量的水，揮發(fā)油提取器加熱回流提取5h，靜置1h，取油層，即得。

2.2 含量測定方法

2.2.1 溶液配制 對照品溶液制備：取桉油精標(biāo)準(zhǔn)品約5mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，即得。供試品溶液的制備：取揮發(fā)油約10mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，加乙腈至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾（0.45μm），取續(xù)濾液，即得。陰性溶液制備：處方中缺豆蔻藥材，其余藥材量不變，按2.1項下方法提取揮發(fā)油，按供試品溶液制備方法制成陰性溶液，即得。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性研究 色譜柱：Diamonsil C18（2）（250nm×4.6nm，5μm）；檢測波長：203nm；流動相：水-乙腈（53:47）；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，供試品圖譜中干擾峰對桉油精峰無干擾，并與桉油精峰達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)大于20000，峰型尖銳，基線平穩(wěn)。色譜圖見圖1。

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密稱取桉油精對照品適量，加乙腈制成0.6595 mg/mL溶液，分別吸取1、3、5、7、10、15、20、25、30μL，按上述色譜條件測定峰面積，以桉油精進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=118.48X+4.0292，r=0.9999，表明進(jìn)樣量在1.319～39.570μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4 精密度實驗 精密吸取10μL對照品溶液，重復(fù)測定6次，以桉油精峰面積計算，RSD為0.35%，表明儀器精密度好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24h 進(jìn)樣，每次 10μL，同法測定，以桉油精峰面積計算，RSD為0.48%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 重復(fù)性實驗 取同一批揮發(fā)油，按2.2.1項下制備6份供試品溶液，分別測定，每次10μL，測定含量RSD為1.27%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.2.7 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的揮發(fā)油6份，每份約5mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，分別精密加入含桉油精約8.313mg/mL的對照品溶液1mL，按2.2.1項下供試品溶液制備方法制備，即得。按2.2.2項下方法測定含量，計算加樣回收率，結(jié)果桉油精的平均加樣回收率（n=6）為103.60%，RSD為1.11%。

圖1 系統(tǒng)適用性實驗HPLC圖

表1 桉油精加樣回收試驗

2.3 樣品測定

按2.1項下方法提取3批揮發(fā)油。每批測定2份。測定結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

本實驗考察了在相同色譜條件下，不同色譜柱的分離效果?？疾炝藀henomenex luna C18（2）（150mm×4.6mm，5μm），Dikma Diamonsil C18（2）

（250mm×4.6mm，5μm），luna色譜柱不能分離，Diamonsil色譜柱分離效果好，柱長對其影響較大。

表2 樣品含量測定（mg/mL）

3.2 洗脫條件的選擇

同時使用供試品和陰性供試品，以保證即能達(dá)到分離效果，又能確保陰性無干擾，考察了乙腈-水（70∶30）；乙腈-水（64∶36）；乙腈-水（60∶40）；乙腈-水（48∶52）；乙腈-水（47∶53）；乙腈-水（46∶54）；乙腈-水（45∶55）；乙腈-水（40∶60）；乙腈-水（25∶75），結(jié)果顯示乙腈-水（47∶53）能夠基線分離，且陰性對照無干擾，含量測定方法簡便可行。

3.3 波長選擇

采用紫外-可見分光光度計對桉油精標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行200～800nm掃描，桉油精為末端吸收，200～350nm有一定紫外吸收，350nm后幾乎無吸收，且在吸收區(qū)間內(nèi)為波長與吸光度的單調(diào)遞減函數(shù)。文獻(xiàn)在建立桉油精HPLC分析時使用203nm下分析，干擾小，結(jié)果可行[13，16]。本研究參考文獻(xiàn)值203nm，桉油精分離效果好，干擾小。

3.4 氣相色譜法

按中國藥典2010版豆蔻項下含量測定法[17]對 20140804、20140805、20140806批揮發(fā)油測定，桉油精平均含量645.76mg/mL，RSD為1.07%。故認(rèn)為本研究中HPLC法可以代替氣相色譜控制揮發(fā)油質(zhì)量。

本研究品種具有平肝理氣、除脹止痛、疏肝和胃之功效，用于治療婦女經(jīng)期綜合征。方中揮發(fā)油是該品種發(fā)揮藥效的重要組成部分，本實驗建立揮發(fā)油質(zhì)量控制方法，是成品質(zhì)量得到保證的依據(jù)。

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