熊果酸誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡過程中活性氧的生物學(xué)功能探討

費(fèi)選文 張?zhí)K偉 孟令英

廣東省汕頭市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東汕頭515031

熊果酸（UA）屬于五環(huán)三萜類化合物，廣泛分布于自然界中[1-5]。UA對(duì)多種致癌和促癌物質(zhì)均有不同程度的抵抗作用，并且能夠抑制多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞的生長[1-5]。Ning等[6]（2012年）探討了來源于髓系的人白血病細(xì)胞U937中由UA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，結(jié)果表明，PKB失活和JNK活化在UA引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。活性氧自由基（ROS），包括H2O2和超氧化物自由基，引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，這正是內(nèi)源性凋亡途徑的啟動(dòng)因素，如Azhar等[7]（2011年）發(fā)現(xiàn)，在人白血病細(xì)胞株THP-1中，化合物誘導(dǎo)的凋亡與ROS的生成及JNK激活有關(guān)，用NAC抑制ROS的產(chǎn)生可以抑制JNK信號(hào)激活及凋亡，這說明正是ROS水平的增高引起上述過程。

本文通過UA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，針對(duì)性檢測ROS這一關(guān)鍵分子靶點(diǎn)，探討ROS在UA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡過程中的作用，為UA臨床應(yīng)用積累有價(jià)值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562以及熊果酸由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；RPMI-1640購自GIBCO；Annexin V/PI、DCFH-DA熒光染料購自Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

K562細(xì)胞在含10%胎牛血清和100U/L青霉素以及100U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基里懸浮培養(yǎng)。取1×106個(gè)/mL濃度的細(xì)胞分四組，分別以0、10、20、40μmol/L UA 作用 48h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)生長期各組K562細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶，48h后分別加入 10、20、40μmol/L 濃度的 UA，處理48h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍攝記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測

收集四組處理后的細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取1×106個(gè)重懸的細(xì)胞，1500rpm離心5min后棄上清，加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。再加入5μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫（20～25℃）避光孵育10min。1500rpm離心5min，棄上清，加入190μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測

DCFH-DA自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在的情況下被氧化成DCF，后者的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。收集處理后1×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，PBS洗滌后，加入1mL Hanks液重懸，加入2.5mmol/L的CDFH-DA液40μL，使終濃度為100μmol/L，在37℃下避光孵育1h，PBS洗滌后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，熊果酸誘導(dǎo)凋亡及ROS水平試驗(yàn)檢測數(shù)據(jù)用（）表示，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化

10μmol/L濃度組整個(gè)時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；20μmol/L濃度組可見少許細(xì)胞變形、壞死，隨著時(shí)間的延長變形、壞死的細(xì)胞有增多趨勢；40μmol/L濃度組可見細(xì)胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現(xiàn)象。見圖1。

2.2 UA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡

不同濃度組的UA作用K562細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明，UA作用K562細(xì)胞48h后，隨著UA濃度的增高細(xì)胞凋亡率也增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表 1。

圖1 UA作用K562細(xì)胞后形態(tài)學(xué)觀察

表1 不同濃度UA作用K562細(xì)胞 48h后細(xì)胞凋亡率結(jié)果（± s，%）

表1 不同濃度UA作用K562細(xì)胞 48h后細(xì)胞凋亡率結(jié)果（± s，%）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01

UA濃度 K562細(xì)胞凋亡率空白對(duì)照組 6.51±0.35 10μmol/L 21.66±0.81*20μmol/L 40.55±1.01*40μmol/L 70.21±3.99*F 46.053 P 0.0001

2.3 UA降低K562細(xì)胞內(nèi)ROS水平

不同濃度組的UA作用K562細(xì)胞后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組的細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果表明，UA作用K562細(xì)胞48h后，隨著UA濃度的增高細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈升高趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 不同濃度UA作用K562細(xì)胞48h后細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)果（± s）

表2 不同濃度UA作用K562細(xì)胞48h后細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)果（± s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01

UA濃度 K562細(xì)胞內(nèi)ROS水平空白對(duì)照組 8.01±2.78 10μmol/L 48.96±5.12*20μmol/L 63.17±4.01*40μmol/L 73.28±2.81*F 28.101 P 0.0002

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病是一種侵襲血液及骨髓的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，它以產(chǎn)生大量的不成熟白細(xì)胞為主要特點(diǎn)，這些不成熟的白細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制正常的骨髓造血功能，并且通過血液循環(huán)在全身擴(kuò)散，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)貧血、出血傾向、感染及器官浸潤等癥狀[8-16]。

細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的主要方式，凋亡機(jī)制的紊亂是腫瘤發(fā)生的重要原因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤的重要手段，同時(shí)也是臨床上腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。

本研究結(jié)果顯示，UA 10μmol/L濃度組整個(gè)時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)變化不明顯；20μmol/L濃度組可見少許細(xì)胞變形、壞死，隨著時(shí)間的延長變形、壞死的細(xì)胞有增多趨勢；40μmol/L濃度組可見細(xì)胞變形、核固縮、核碎裂和胞膜突起等現(xiàn)象。UA作用K562細(xì)胞48h后，隨著UA濃度的增高細(xì)胞凋亡率也增高，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

UA是一種新近發(fā)現(xiàn)的治療白血病中藥，是五環(huán)三萜類化合物中的一個(gè)代表性藥物。有研究表明UA可以通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)殺傷白血病細(xì)胞的目的，在誘導(dǎo)凋亡的過程中需要細(xì)胞內(nèi)的氧自由基的參與[17]。五環(huán)三萜類化合物的抗腫瘤作用機(jī)理非常復(fù)雜，研究者們?cè)噲D從不同的方向解析其機(jī)制，很難對(duì)此類各種不同的化合物效應(yīng)歸納出一個(gè)通用的作用模式，但是近年來的發(fā)現(xiàn)逐漸形成一個(gè)統(tǒng)一的主題：它們啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)源和外源的兩種凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

外源性凋亡途徑是由細(xì)胞表面的死亡受體的激活所啟動(dòng)的，在多種癌細(xì)胞中五環(huán)三萜類化合物celastrol南蛇藤素增加腫瘤壞死因子（TNF）死亡受體家族的死亡受體4（DR4）的表達(dá)[18]。內(nèi)源性凋亡途徑又稱作線粒體凋亡途徑，研究表明，在伊馬替尼耐藥細(xì)胞株KBM5中CDDO-Me主要是通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡，低濃度的CDDO-Me抑制線粒體ROS的消耗，而細(xì)胞毒性效應(yīng)則是伴隨迅速有選擇性地使GSH下降，ROS升高。

ROS是真核生物有氧呼吸的產(chǎn)物包括H2O2和超氧化物自由基等，可以引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激。ROS具有反應(yīng)活性高、能快速與胞內(nèi)大分子物質(zhì)起反應(yīng)的特點(diǎn)，可以引起細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的病理性損傷。然而，細(xì)胞內(nèi)存在抗氧化酶類，拮抗這類物質(zhì)的氧化損傷，清除細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的ROS物質(zhì)，使得細(xì)胞內(nèi)的ROS的產(chǎn)生和清除處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。研究表明ROS可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，從而引起相關(guān)的生物基因表達(dá)，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和凋亡的生物學(xué)功能。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡被破壞時(shí)，細(xì)胞就會(huì)受到氧化損傷，甚至死亡[19]。大量的研究證實(shí)ROS是細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路之一[20]。本研究結(jié)果顯示，10μmol/L的UA就可使K562細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著升高，并且隨著ROS濃度的增高ROS水平也增高，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并可能由此激活相對(duì)應(yīng)的效應(yīng)機(jī)制從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，刺激細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是UA誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

綜上所述，ROS可以誘導(dǎo)K562細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。其可能的凋亡信號(hào)通路為：UA作用于K562細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)的ROS水平升高，繼而產(chǎn)生細(xì)胞的氧化損傷，激活相關(guān)的凋亡機(jī)制從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。

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