高效石油烴降解菌CQ6的分離鑒定及He—Ne激光誘變

付瑞敏 康治華 彭瑞強(qiáng) 陳五嶺

摘要：從長(zhǎng)慶油田石油污染土壤中分離得到一株產(chǎn)生生物表面活性劑的高效石油烴降解菌。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)研究，篩選出的菌株CQ6被鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。為了增強(qiáng)該菌降解石油烴的能力，對(duì)其進(jìn)行He-Ne激光誘變，獲得6株突變株，通過(guò)檢測(cè)其表面張力、排油圈直徑和烴降解率，降解石油烴能力最強(qiáng)且遺傳性狀穩(wěn)定的突變株CQ66被挑選出來(lái)。本研究表明，He-Ne激光誘變育種技術(shù)可有效改良石油烴降解菌，該手段對(duì)修復(fù)石油污染土壤具有現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)鍵詞：石油烴降解菌；表面活性劑；He-Ne激光誘變；遺傳穩(wěn)定性

中圖分類(lèi)號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0404-03

隨著石油工業(yè)的快速發(fā)展，在石油勘探、開(kāi)采、運(yùn)輸及煉制等過(guò)程都會(huì)出現(xiàn)原油的泄漏，從而對(duì)土地和鄰近水體造成嚴(yán)重污染[1]。這些原油可通過(guò)生物學(xué)或非生物學(xué)途徑而逐步降解。研究表明，消除石油烴污染的各個(gè)因素中，微生物降解具有重要作用，當(dāng)前已報(bào)道有多種微生物具有降解石油烴并產(chǎn)生表面活性劑的能力[2-4]。李倩等制備石油烴降解菌劑并將其應(yīng)用于溢油岸灘的生物修復(fù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)28 d的生物修復(fù)，其石油烴降解率最高達(dá)45.07%[5]?？梢?jiàn)采用現(xiàn)代育種技術(shù)選育石油烴降解菌對(duì)于石油污染區(qū)域的生物修復(fù)具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值。 激光可通過(guò)光、電、熱和電磁等綜合作用引起菌體細(xì)胞基因發(fā)生改變，從而使所產(chǎn)生的酶發(fā)生激活或鈍化[6]。低能量的He-Ne激光作用于菌體細(xì)胞，可促進(jìn)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)而提高代謝物產(chǎn)量，當(dāng)前引起了微生物育種者的廣泛關(guān)注[7]。本研究針對(duì)長(zhǎng)慶油田石油污染土壤，進(jìn)行了石油烴高效降解菌的分離、鑒定，并通過(guò)He-Ne激光輻射誘變育種，選育出一株遺傳性能穩(wěn)定的高效石油烴降解菌，以期為石油污染土壤的生物修復(fù)提供數(shù)據(jù)參考。

1 試驗(yàn)材料

1.1 菌種來(lái)源

從長(zhǎng)慶油田石油污染土壤中提取。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基 MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，F(xiàn)eCl3 0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。

1.2.2 選擇培養(yǎng)基 將2 g原油抽濾滅菌后加到上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，即為液體選擇培養(yǎng)基，也叫原油發(fā)酵培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入15 g瓊脂制成相應(yīng)的固體選擇培養(yǎng)基，即為油平板。試驗(yàn)所用原油采自長(zhǎng)慶油田G010-18 井。

1.2.3 LB培養(yǎng)基 蛋白胨8 g，氯化鈉7 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，即為液體培養(yǎng)基；固體培養(yǎng)基的瓊脂添加量控制在15%～18%。

1.2.4 復(fù)壯培養(yǎng)基 蛋白胨8 g，氯化鈉7 g，酵母浸膏5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，葡萄糖50 mmol/L

1.3 試驗(yàn)儀器

He-Ne激光發(fā)生器（波長(zhǎng)632 nm，功率10 mW），由西北大學(xué)光電廠(chǎng)生產(chǎn)；WZY-1自動(dòng)液體表面張力儀，由上海衡平制造廠(chǎng)生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株培養(yǎng)

菌株分離自長(zhǎng)慶油田G010-18 井周邊污染土壤。將100 mL選擇液體培養(yǎng)基加入到250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，而后稱(chēng)取5 g污染土壤置于其中，透氣封口膜封住瓶口，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d。

2.2 菌株篩選與分離

2.2.1 初篩 采用梯度稀釋法，將培養(yǎng)后的菌液用無(wú)菌水連續(xù)稀釋101～107倍，取10-5、10-6、10-7的梯度稀釋液分別涂布于以石油烴為唯一碳源的油平板上，每個(gè)稀釋度均做3個(gè)平行試驗(yàn)，將其置于37 ℃培養(yǎng)3 d，能在油平板上生長(zhǎng)的就是石油烴降解菌。將石油烴降解菌通過(guò)平板劃線(xiàn)獲得單菌落，將其轉(zhuǎn)至斜面，4 ℃保存。

2.2.2 復(fù)篩 為了進(jìn)一步檢測(cè)石油烴降解菌對(duì)石油烴的降解能力，采用表面張力檢測(cè)、排油圈[8]和烴降解率[9]等3種方法進(jìn)行復(fù)篩。（1）表面張力檢測(cè)[8]。將篩選出的石油烴降解菌菌株活化，以2%的比例接入葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，使用張力儀檢測(cè)發(fā)酵液的表面張力。（2）排油圈[8]。取90 mm培養(yǎng)皿，加入 50 mL 去離子水，滴加0.1 mL液體石蠟于水面，石蠟中心加入10 μL發(fā)酵液，發(fā)酵液會(huì)將石蠟擠向四周形成圓圈，菌株所產(chǎn)生表面活性劑的量及活性同該圓圈的直徑成正比。通過(guò)對(duì)比各菌株所形成的排油圈，選取排油圈直徑最大的菌株作深入研究。上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。（3）烴降解率[9]。將石油烴降解菌菌液以10%的比例接入50 mL的原油發(fā)酵培養(yǎng)基中，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，按照文獻(xiàn)[9]中方法測(cè)定培養(yǎng)液中原油降解率，計(jì)算石油烴降解率。

降解率（D）=（m1-m7）/m1×100%。

式中：m1為初始發(fā)酵培養(yǎng)基中原油含量；m7為培養(yǎng)7 d殘留油含量。

經(jīng)過(guò)上述試驗(yàn)，即可選出降解石油烴能力最強(qiáng)的菌株。

2.3 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定

參照文獻(xiàn)[10-11]對(duì)所選的降解石油烴能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定（包括革蘭氏染色、芽孢染色和大小測(cè)定等），并參照微生物試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該菌進(jìn)行生理生化測(cè)定（包括過(guò)氧化氫酶反應(yīng)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、IMViC試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)和耐鹽性試驗(yàn)等），上述試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.4 16S rDNA序列分析

參照Fani等的方法[12]，采用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的試劑盒提取所選菌株的DNA和回收其16S rDNA片段。16S rDNA 的PCR擴(kuò)增引物采用通用引物（27F：5′-AGAGTTGTCATGGCTC-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′），該引物合成自上海生工。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將所得PCR產(chǎn)物回收純化并提交目的片段至上海生工進(jìn)行基因測(cè)序，所得序列采用MEGA 3.0同NCBI上的相近物種的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，樹(shù)的聚類(lèi)穩(wěn)定性進(jìn)行1 000次自導(dǎo)檢驗(yàn)[13]。

2.5 He-Ne激光誘變和突變株的選育

2.5.1 誘變前的活化

將所選菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h后，用5 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗斜面后將其置于三角瓶中（內(nèi)含玻璃珠），充分振蕩混勻，采用光電比濁計(jì)數(shù)法將菌懸液的D值調(diào)節(jié)至0.986，使其濃度為108 CFU/mL。

2.5.2 He-Ne激光誘變[14]

取2 mL菌懸液分別置于無(wú)菌試管中，將 He-Ne 激光的輸出功率調(diào)節(jié)為10 mW，照射距離調(diào)節(jié)為 25 cm，照射時(shí)間為5、10、15、20、25 min，以原菌液為對(duì)照，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2.5.3 誘變菌培養(yǎng)

無(wú)菌條件下取1 mL激光照射后的菌液，將其置于裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，作為10-1，振蕩混勻后再以同樣方法將其稀釋至10-5、10-6、10-7，從3個(gè)梯度的稀釋液中各取0.2 mL涂平板，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，37 ℃ 培養(yǎng)20 h后，以原菌懸液作為對(duì)照，進(jìn)行菌落形態(tài)觀(guān)察和菌落計(jì)數(shù)。

2.5.4 存活率和正突變率的計(jì)算

將激光誘變后的菌懸液用復(fù)壯培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為280 r/min 、37 ℃下培養(yǎng)6 h，而后使用梯度稀釋法將其稀釋至10-6，分別取0.1 mL 10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布在油平板上，以未照射的菌液為對(duì)照，37 ℃、96 h后觀(guān)察生長(zhǎng)狀況，并計(jì)算存活率和正突變率：

存活率=誘變后活菌數(shù)/誘變前活菌數(shù)×100%；

正突變率=正突變菌株數(shù)/誘變后活菌數(shù)×100%。

2.5.5 挑取優(yōu)良突變株

通過(guò)菌落形態(tài)觀(guān)察和計(jì)數(shù)，從誘變后的菌株中挑選出菌落形態(tài)變化較大、長(zhǎng)得又快又好且透明圈明顯的突變株，通過(guò)表面張力檢測(cè)、排油圈和烴降解率等方法檢測(cè)正突變株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力，并挑選優(yōu)良突變株。

2.5.6 突變株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將挑選出的降解石油烴能力最強(qiáng)的突變株轉(zhuǎn)接至LB平板上，作為第1代，然后以相同方法連續(xù)繼代20代，每隔4代分別將其按照10%的比例接入原油發(fā)酵培養(yǎng)基中，280 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)其降解率和表面張力，并將其與第1代菌株比較，確定突變株的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)果與分析

3.1 石油烴降解菌的篩選與分離

從長(zhǎng)慶油田石油污染土壤中分離得到可在油平板上生長(zhǎng)且產(chǎn)生透明圈的石油烴降解菌6株，分別為CQ1、CQ2、CQ3、CQ4、CQ5和CQ6，經(jīng)過(guò)表面張力、排油圈和烴降解率等方法檢測(cè)，結(jié)果如表1所示：6株菌對(duì)石油烴的降解能力和產(chǎn)生表面活性劑的能力有較為顯著的差異，菌株CQ6的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他菌株，且表面張力低于其他菌株?；诖?，說(shuō)明菌株CQ6的降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力最強(qiáng)，因此選取菌株CQ6進(jìn)行后續(xù)研究。

3.2 石油烴降解菌CQ6的表型特征和生理生化特性

將上述所選的石油烴高效降解菌株CQ6挑選出來(lái)并進(jìn)行顯微鏡鏡檢和菌落形態(tài)觀(guān)察。結(jié)果顯示：該菌個(gè)體形態(tài)為桿狀，G-，產(chǎn)橢圓形芽孢，芽孢囊膨大，菌落干燥、不透明且有皺褶，菌落邊緣有不規(guī)則擴(kuò)散。

對(duì)CQ6進(jìn)行生理生化檢測(cè)，結(jié)果顯示：CQ6為嚴(yán)格好氧菌，抗氯化鈉2%、5%、7%、10%，可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，IMViC試驗(yàn)結(jié)果為-+++，淀粉水解和酪素水解試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

通過(guò)分析CQ6的表型特征和生理生化特征，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)和生理生化特點(diǎn)均和枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相同，據(jù)此，可初步判定菌株CQ6為芽孢桿菌屬。

3.3 CQ6的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育研究

菌株CQ6的16S rDNA片段（約1 500 bp）的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，將所得PCR產(chǎn)物測(cè)序，得到 1 492 bp 的序列，將該序列和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的各近緣菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用Bioedit7.0軟件進(jìn)行多重比較，分析其同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），經(jīng)分析，所得序列和Bacillus pumilus（登錄號(hào)：X60637）顯示了99%的同源性，根據(jù)其系統(tǒng)進(jìn)化特征，可確定菌株CQ6為短小芽孢桿菌。

3.4 突變株篩選

用激光照射誘變育種的生物學(xué)效應(yīng)主要是引起基因突變從而使酶激活或鈍化，激光照射時(shí)間會(huì)導(dǎo)致突變率發(fā)生變化，照射時(shí)間越長(zhǎng)，突變率越高，但是致死率也隨之升高，因此要挑選合適的照射時(shí)間以保證一定的突變率和控制致死率。用激光對(duì)石油烴降解菌CQ6照射不同時(shí)間，結(jié)果如表2所示。

由表2可以看出，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株的存活率不斷下降，正突變率的變化趨勢(shì)是先升高后降低，推斷造成這種情況的原因是由于照射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅會(huì)導(dǎo)致活菌數(shù)劇烈下

降，也會(huì)使更多的菌株出現(xiàn)負(fù)突變，因此，綜合考慮，CQ6的最佳照射時(shí)間選為15 min。

采用排油圈檢測(cè)、表面張力檢測(cè)和烴降解率等方法，5株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力均強(qiáng)于親本CQ6的菌株被挑選出來(lái)，分別編號(hào)為CQ61、CQ63、CQ65、CQ66和CQ67，其降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的結(jié)果如表3所示。

如表3所示，突變株CQ66的排油圈直徑和石油烴降解率均高于其他突變株，且表面張力低于其他突變株，說(shuō)明該突變株的降解石油烴能力和產(chǎn)生表面活性劑能力是突變株中最強(qiáng)的，故將其挑選出來(lái)，用于后續(xù)研究。

3.5 突變株遺傳穩(wěn)定性研究

把石油烴降解能力和產(chǎn)生表面活性劑能力均有所提高的突變株CQ66繼代培養(yǎng)20代，每隔4代的菌株分別做石油烴降解率和表面張力試驗(yàn)，結(jié)果（表4）表明各代降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的能力基本一致，說(shuō)明突變株CQ66的降解石油烴能力的遺傳穩(wěn)定性良好。

4 討論

本研究從長(zhǎng)慶油田石油污染的土壤中分離篩選得到一株高效降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的菌株CQ6，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和分子鑒定確定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。

為了增強(qiáng)該菌株降解石油烴的能力和產(chǎn)生表面活性劑的能力，對(duì)所選菌株進(jìn)行He-Ne激光誘變育種，并確定最佳照射時(shí)間為15 min。

He-Ne激光誘變后，采用排油圈檢測(cè)、表面張力檢測(cè)和烴降解率等方法挑選出降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑能力最強(qiáng)的突變株CQ66，并對(duì)其進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)， 試驗(yàn)結(jié)果表明，該突變株降解石油烴和產(chǎn)生表面活性劑的遺傳性狀穩(wěn)定，可用于制備固體菌劑或液體菌劑應(yīng)用于長(zhǎng)慶油田石油污染土壤的生物修復(fù)。

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