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    國外引進(jìn)雙孢菇菌種與國內(nèi)栽培菌種的RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜分析

    2015-08-20 05:46:56張欣倪王鴻磊丁強(qiáng)呂蔚鄒積華崔從光俞守能
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:親緣關(guān)系雙孢菇

    張欣倪 王鴻磊 丁強(qiáng) 呂蔚 鄒積華 崔從光 俞守能

    摘要:利用RAPD和酯酶同工酶指紋圖譜對國內(nèi)主栽的2個雙孢菇菌株及從荷蘭、美國引進(jìn)的8個雙孢菇菌株進(jìn)行親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明,從47個RAPD引物中篩選了14個條帶清晰重復(fù)性好的引物,共產(chǎn)生了88條清晰的擴(kuò)增條帶,其中多態(tài)性條帶64條,多態(tài)性位點百分率為72.73%,10個菌株可分為4個類群;酯酶同工酶電泳共擴(kuò)增出了清晰條帶7條,其中多態(tài)性條帶6條,多態(tài)性位點百分率為85.8%,10個菌株可分為3個類群。2種技術(shù)均顯示,國內(nèi)菌株與國外引進(jìn)菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此,引進(jìn)國外優(yōu)質(zhì)雙孢菇菌株對增加中國雙孢菇遺傳多樣性具有重要作用。

    關(guān)鍵詞:雙孢菇;酯酶同工酶;RAPD;親緣關(guān)系

    中圖分類號: S646.032 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0254-03

    雙孢菇(Agaricus bisporus)是中國廣泛栽培的一種中低溫性食用菌,近年來產(chǎn)量不斷增加。但是,中國的雙孢蘑菇品種之間遺傳關(guān)系較近[1],且缺乏系統(tǒng)的歸類整理,導(dǎo)致中國目前市場上菌種的同種品種不同名稱,或者是不同品種同一名稱的混雜現(xiàn)狀,直接影響了中國雙孢菇菌種的生產(chǎn)、種質(zhì)資源的保護(hù)和優(yōu)良菌種選育。采用合理有效技術(shù)對雙孢蘑菇進(jìn)行品種劃分,區(qū)分其品種親緣關(guān)系,鑒定雙孢蘑菇的品系顯得尤為重要。

    RAPD技術(shù)是Williams研究小組提出的一種分子標(biāo)記技術(shù)[2-3]。該技術(shù)通過人工合成的核酸單鏈(常為10個堿基)為引物,以試驗對象的DNA為模版,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)生一系列不同分子量的基因片段,不同引物的凝膠電泳結(jié)果,可以作為品系的遺傳特征進(jìn)行記錄,用于品種鑒定。RAPD技術(shù)設(shè)備簡單,技術(shù)簡便易行,目前,已廣泛應(yīng)用于不同物種的遺傳多樣性研究[4-9]。同工酶分子標(biāo)記是從基因產(chǎn)物水平來研究生物的遺傳變異,是一種重要的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)[10],酶帶的變化可作為鑒定物種,研究分類、進(jìn)化、遺傳與變異的重要指標(biāo)。自1959年Markert等提出酯酶同工酶概念后,酯酶同工酶標(biāo)記技術(shù)在許多食用菌研究中得到了廣泛的重視和應(yīng)用[11-14]。高分辨率的同工酶技術(shù)成為生化分類的主要方法之一[15]。

    本研究利用RAPD和酯酶同工酶技術(shù)對中國的2個主栽雙孢菇菌株及從荷蘭、美國引進(jìn)的8個優(yōu)質(zhì)雙孢菇菌株進(jìn)行遺傳相似性分析,從分子水平上研究雙孢菇菌株之間的親緣關(guān)系和遺傳差異,為雙孢菇菌株的鑒定提供技術(shù)支持,同時為雙孢菇種質(zhì)資源的引進(jìn)及引進(jìn)菌株在雙孢菇遺傳育種方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種 (1)258、2796本實驗室保藏;(2)H901、HRLM、F3F、HA15引自荷蘭;(3)L901、5113、XXX、2200引自美國。

    1.1.2 PCR試劑 RAPD引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成,Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA marker、Gelstain等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    1.1.3 儀器設(shè)備 JY300C電泳儀:北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn);藍(lán)盾580可見光凝膠電泳透射儀:廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn);A200PCR儀:杭州朗基科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);04S-3C全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng):北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn);3K30冷凍高速離心機(jī):德國Sigma公司生產(chǎn)。

    1.2 方法

    1.2.1 RAPD分析 雙孢菇菌株利用PDA液體培養(yǎng)基[16],24 ℃ 150 r/min 培養(yǎng)14 d,過濾收集菌絲體。菌絲體DNA提取采用CTAB法[17]。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,紫外分光光度計檢測 DNA濃度,稀釋至10 ng/μL,于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為15 μL,含1×PCR緩沖液、DNA模板 20 ng,dNTPs 200 mmol/L,引物0.3 μmol/L,TaqDNA聚合酶 1 U。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性7 min;94 ℃變性1 min,退火1 min(退火溫度視引物而定),72 ℃延伸2 min,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min,4 ℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,電壓4 V/cm,Gelstain染色,凝膠成像系統(tǒng)觀察并照相。

    1.2.2 酯酶同工酶分析 稱取0.5 g菌絲體,置于預(yù)冷的滅菌研缽中,加1 mL 樣品提取液,加少量滅菌石英砂,冰浴研磨,收集于1.5 mL離心管中。4 ℃ 10 000 r/min 離心5 min,將上清液、蔗糖溶液、溴酚藍(lán)溶液按5 ∶1 ∶1的比例混合,即為電泳樣品[18]。電泳分離膠濃度為7.5%,濃縮膠濃度為48%,電極緩沖液采用Tris-Gly系統(tǒng),以1%溴酚藍(lán)作指示劑。電泳初始電流10 mA,待樣品進(jìn)入分離膠后電流升至 20 mA,在0~4 ℃下電泳至溴酚藍(lán)指示劑距膠底1 cm停止電泳。用1%醋酸-1-萘酯、2%醋酸-2-萘酯和固藍(lán)RR鹽4 ℃染色15~30 min,用蒸餾水沖洗數(shù)次后置于乙酸溶液中固定,凝膠成像系統(tǒng)拍照[19]。

    1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用NTSYSpc 2.10對電泳條帶進(jìn)行分析,計算各雙孢菇菌株間的Nei氏遺傳相似性及遺傳距離,以平均連鎖法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,得出聚類圖譜[20]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 雙孢菇菌株RAPD分析

    利用47條引物對10個雙孢菇菌株進(jìn)行了RAPD擴(kuò)增,其中14條引物擴(kuò)增出了清晰且具有多態(tài)性的條帶,共產(chǎn)生了清晰的擴(kuò)增條帶88條,其中多態(tài)性條帶64條,多態(tài)性位點百分率為72.73%,結(jié)果見表1。

    利用NTSYSpc 2.10計算菌株間遺傳距離,以平均連鎖法(UPGMA)對10個雙孢菇菌株進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建10個雙孢菇菌株的親緣關(guān)系圖譜(圖1)。

    從RAPD聚類圖(圖1)可見,8個引進(jìn)菌株與2個國內(nèi)主栽菌株的差異明顯,遺傳相似性只有0.53,在聚類圖上明顯分為2個分支。國內(nèi)主栽的2個品種遺傳差異較小,相似性達(dá)到0933,可歸為1個類群。國外引進(jìn)的8個菌株可分為3個類群,其中HRLM菌株與其他7個菌株差異較大,單獨歸為1個類群。引自美國的L901和引自荷蘭的F3F、HA15親緣關(guān)系較近,歸為1個類群,荷蘭菌株H901與美國菌株5113、2200、XXX歸為1個類群,這2個類群親緣關(guān)系較近,遺傳相似性接近0.88。

    2.2 酯酶同工酶聚類分析

    10個雙孢菇菌株酯酶同工酶圖譜見圖2,共擴(kuò)增出了清晰條帶7條,其中多態(tài)性條帶6條,多態(tài)性位點百分率為85.8%。

    利用NTSYSpc 2.10計算菌株間遺傳距離,以平均連鎖法

    (UPGMA)對10個雙孢菇菌株進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建10個雙孢菇菌株的親緣關(guān)系圖譜(圖3)。

    10個不同品種雙孢蘑菇的酯酶同工酶電泳圖譜帶在位置、寬窄、濃淡以及數(shù)量等方面都體現(xiàn)出了一定的差異性。從圖譜上看,10個雙孢菇菌種分為3群,中國品種2796、258、荷蘭品種HRLM譜帶相同,荷蘭菌種H901、HA15、美國菌種L901譜帶相同,美國菌種5113、XXX、2200和荷蘭菌種F3F譜帶相同。中國品種與HRLM親緣關(guān)系較近,而其他引進(jìn)品種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    3 討論

    中國是雙孢菇生產(chǎn)大國,但不是雙孢菇生產(chǎn)強(qiáng)國,菌種是制約中國雙孢菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展最重要的因素之一。我國雙孢菇菌株親緣關(guān)系過于接近,影響我國雙孢菇育種等工作的順利開展。本研究結(jié)果表明,國外優(yōu)質(zhì)雙孢菇菌株與中國主栽菌株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn),為我國雙孢菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了一條新的思路。通過引進(jìn)國外優(yōu)質(zhì)菌株,與國內(nèi)菌株進(jìn)行雜交育種,對提高中國雙孢菇遺傳多樣性、雙孢菇產(chǎn)量和抗病性等方面具有重要的作用。

    同時,國外菌株在遺傳相似性方面也相對比較接近,在引種時要對引進(jìn)菌株進(jìn)行親緣關(guān)系檢測,避免菌株的重復(fù)引進(jìn)。RAPD和酯酶同工酶電泳均可以反映菌株間的親緣關(guān)系[21],而RAPD標(biāo)記檢測的多態(tài)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酯酶同工酶標(biāo)記[22],同時,當(dāng)菌株親緣關(guān)系接近時酯酶同工酶酶譜與RAPD譜帶存在差異性。在實際應(yīng)用過程中,應(yīng)將二者有機(jī)結(jié)合起來,以獲得更加可靠的試驗結(jié)果。

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