姚江水系中華鱉不同組織3種同工酶的表達(dá)差異

鄭小青　梅依霞　洪炆飛　汪財生　唐偉　錢國英　李彩燕

摘要：采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，對姚江水系中華鱉（Pelodiscus sinensis）的6種組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、肺）中的乳酸脫氫酶（LDH）、酯酶（EST）、谷氨酸脫氫酶（GDH） 3種同工酶進(jìn)行了初步研究，并與日本品系中華鱉的同工酶譜圖進(jìn)行了對比。結(jié)果表明：2個品系中華鱉的同工酶具有不同程度的組織特異性，LDH組織差異極為明顯；姚江水系中華鱉相同組織LDH整體表達(dá)量與日本中華鱉類似，EST-1表達(dá)量高于日本中華鱉，GDH整體表達(dá)量低于日本中華鱉，肌肉中GDH-3表達(dá)量高于日本中華鱉。本研究得到了姚江群體中華鱉的標(biāo)志性酶譜，并明確了其與日本品系中華鱉酶譜的差異和特殊性。

關(guān)鍵詞：中華鱉；同工酶；表達(dá)；組織特異性；乳酸脫氫酶；酯酶；谷氨酸脫氫酶

中圖分類號： S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0244-03

中華鱉（Pelodiscus sinensis）又稱水魚、團(tuán)魚、元魚、甲魚等，是我國重要的特種經(jīng)濟(jì)動物和名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。近10余年來，在養(yǎng)鱉業(yè)蓬勃發(fā)展的同時，人們對野生資源的不合理開發(fā)加劇，中華鱉的生存形勢持續(xù)惡化，原種資源不斷減少。過度的食用消費(fèi)、棲息地的破壞、化學(xué)污染等因素導(dǎo)致我國中華鱉種質(zhì)資源遭受嚴(yán)重破壞，種群面臨大規(guī)模銳減、瀕臨滅絕的境地，尤其是一些特殊地域種群的原種地沒有引起足夠的重視。如主要分布在寧波姚江流域的姚江水系中華鱉原種已處于瀕危狀態(tài)，野生種質(zhì)資源稀缺。該群體中華鱉抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好、肉質(zhì)鮮美、膠質(zhì)濃郁，深受消費(fèi)者喜愛。姚江水系中華鱉除了具有中華鱉的基本固有特征外，主要特征為腹部有4處明顯花斑，與其他品系中華鱉差異非常明顯。目前，關(guān)于中華鱉同工酶的研究大多集中于黃河群體、太湖群體和臺灣群體[1-3]，而姚江水系中華鱉同工酶表達(dá)差異的研究尚未見報道。為了有效保護(hù)中華鱉的種質(zhì)資源，保持地方種群優(yōu)良的種質(zhì)性狀，應(yīng)用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對姚江水系中華鱉6種不同組織中的乳酸脫氫酶（LDH）、酯酶（EST）、谷氨酸脫氫酶（GDH） 3種同工酶進(jìn)行了研究，并與日本品系中華鱉進(jìn)行比較，以期在蛋白質(zhì)水平上建立其種質(zhì)資源的遺傳標(biāo)記，為該地方品系中華鱉的種質(zhì)鑒定、遺傳分析及良種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為三齡雄性中華鱉，其中姚江水系中華鱉取自浙江省余姚市明鳳淡水養(yǎng)殖場，日本品系中華鱉取自紹興中亞工貿(mào)園有限公司。

1.2 樣品制備

活鱉運(yùn)回實驗室后，迅速殺死取其心臟、肝臟、 腎臟、脾臟、肺和腿部肌肉，稱質(zhì)量后加入Tris-HCl緩沖液（pH值 75）進(jìn)行勻漿，再離心20 min，取其上清液與甘油按1 ∶2混合后，直接電泳或于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 電泳

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法[4-7]，操作步驟參考區(qū)又君等報道的方法[5]進(jìn)行，電泳過程使用夾心式垂直板電泳槽（Mini-PROTEAN Tetra），取10 μL樣品加樣。分離膠濃度為7.5%（pH值8.8），濃縮膠濃度為4.5%（pH值6.8），電極緩沖系統(tǒng)為 Tris-Gly（pH值8.3），在160 V 恒壓、冰浴中電泳2 h（除EST研究的電泳時間為1.5 h外）。

電泳后的凝膠染色參照何忠效等[6]和郭堯軍[7]的操作方法，并加以修改（表1）。在電泳結(jié)束前，提前配制好染色液，其中EST染色液需過濾后使用。電泳后的凝膠置于染色液中直至顯色，LDH、EST檢測凝膠室溫下約染色20 min，GDH檢測凝膠置于37 ℃染色約4 h。經(jīng)蒸餾水清洗染色后的顯色凝膠置于光亮背景下拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

應(yīng)用于種群生化遺傳分析的同工酶譜，除酶帶應(yīng)清晰外，更重要的是反映出編碼該酶的幾個基因座位、存在幾個等位基因、是幾聚體的酶等特征性信息[8]。2個不同品系中華鱉的6種組織中3種同工酶活性強(qiáng)弱結(jié)果見表2。從表2中可以看出，2個品系中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腎臟中LDH、EST 2種同工酶均明顯表達(dá)且含量較高，肺與肌肉中的LDH、EST、GDH 同工酶有所表達(dá)但相比于其他組織的同工酶含量則較少。其中姚江水系中華鱉的6種組織中屬肝臟組織中同工酶的整體表達(dá)量最高，而日本品系中華鱉的6種組織中屬腎臟組織中同工酶的整體表達(dá)量最高。

2.1 乳酸脫氫酶（LDH）

2個品系中華鱉6種組織的LDH同工酶的電泳圖譜如圖1所示。姚江水系中華鱉LDH同工酶在心臟、肝臟、脾臟、腎臟中LDH-5含量最高，肌肉中LDH-1含量最高，肺中LDH-1、LDH-5的表達(dá)量均相對偏高，且在心臟、肝臟、腎臟、肌肉中有LDH-C基因（即LDH-6、LDH-7、LDH-8）表達(dá)。日本品系中華鱉LDH同工酶在心臟、脾臟、腎臟中LDH-5含量最高，肌肉中LDH-1含量最高，肺中LDH-1、LDH-5含量均相對偏高，且在心臟、肝臟、腎臟和肌肉中有LDH-C基因表達(dá)。姚江水系中華鱉相同組織LDH整體表達(dá)量與日本品系中華鱉類似，僅LDH-5在姚江水系中華鱉肝臟中表達(dá)高于日本中華鱉。

2.2 酯酶（EST）

中華鱉不同組織EST同工酶的電泳圖譜如圖2所示。由圖2可見，姚江水系中華鱉EST-1表達(dá)量高于日本品系中華鱉，日本品系中華鱉EST-4表達(dá)量遠(yuǎn)高于姚江水系中華鱉，姚江水系中華鱉的腎臟組織中EST-3表達(dá)量大于日本品系中華鱉。姚江水系中華鱉所有組織的EST-2、EST-3表達(dá)量都較高，EST-4表達(dá)量較低。姚江水系中華鱉的酯酶總活性依次為肝臟>腎臟>心臟>脾臟>肺>肌肉，尤其是EST-2、EST-3在肝臟、腎臟有顯示清晰的酶帶，在脾臟有微弱的酶帶。日本品系中華鱉所有組織的EST-2、EST-3表達(dá)量都較高，EST-1、EST-4表達(dá)量相當(dāng)，其酯酶總活性依次為肝臟>腎臟>心臟>脾臟>肺>肌肉，尤其是 EST-2、EST-3在肝臟、腎臟組織電泳有清晰的酶帶。

2.3 谷氨酸脫氫酶（GDH）

GDH為二聚體酶，在不同品系中華鱉的不同組織的GDH酶譜中均呈現(xiàn)了3個活性區(qū)域（圖3）。姚江水系中華鱉的肝臟、心臟、腎臟、肌肉組織中GDH表達(dá)量較高，其他組織表達(dá)量低，且在肌肉中有GDH-1、GDH-3的表達(dá)。日本品系中華鱉在肝臟、脾臟、腎臟、肌肉中GDH表達(dá)量均較高，其中肝臟中的GDH表達(dá)量最高；GDH-1在肌肉中大量表達(dá)而在其他組織幾乎不表達(dá)；肌肉中未檢測到GDH-2、GDH-3，而其他5種組織中都有所表達(dá)。日本鱉GDH表達(dá)量整體上高于姚江水系中華鱉，但肝臟和心臟組織中2個品系中華鱉的GDH表達(dá)量相近，肌肉組織中姚江水系中華鱉GDH-3的表達(dá)量高于日本中華鱉。

3 結(jié)論與討論

已有學(xué)者采用同工酶電泳分析了不同群體中華鱉的組織表達(dá)特異性[1-3，9-11]。如楊弘等采用垂直淀粉膠電泳對中華鱉腦、眼、心臟、肌肉、肝臟、腎臟和卵巢7種組織中的6種同工酶系統(tǒng)（LDH、ADH、IDH、ME、GAPDH、EST）進(jìn)行研究，構(gòu)建了中華鱉同工酶酶譜，揭示了LDH在中華鱉進(jìn)化上的保守性[2]。姚雁鴻等運(yùn)用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對中華鱉和臺灣鱉的肝臟、腎臟、眼、肌肉等幾種組織中的LDH、EST同工酶進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中華鱉組織中有組織特異性、無多態(tài)性的LDH同工酶在臺灣鱉的組織中卻既有組織特異性又有多態(tài)性[3]。

3.1 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶（LDH）是糖代謝途徑中一種重要的氧化還原酶，存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，能催化丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化，是研究最廣泛的一種同工酶[1-3，9-12]。已經(jīng)證明LDH同工酶系統(tǒng)具有明顯的種族及組織特異性[9，12]。心肌是含氧量豐富的組織，細(xì)胞以有氧代謝為主，催化乳酸生產(chǎn)丙酮酸的LDH-5占優(yōu)勢。骨骼肌是相對缺氧的組織，催化丙酮酸還原生產(chǎn)乳酸的LDH-1占優(yōu)勢，使骨骼肌因激烈運(yùn)動造成的相對缺氧條件下仍能得以酵解獲得能量[13]。

中華鱉作為水陸兩棲的動物，能適應(yīng)較大的含氧量波動，既能適應(yīng)水環(huán)境，也能適應(yīng)短時間的陸上生活，故其肺部LDH-1、LDH-5都有較多表達(dá)。肝臟、腎臟、脾臟中LDH-5占優(yōu)勢的原因與心肌中LDH-5占優(yōu)勢的原因類似，且不同組織其他的酶帶均有所差異，推測LDH可作為姚江水系中華鱉組織特異性鑒定的同工酶。

日本品系中華鱉和姚江品系中華鱉的心臟、肝臟、腎臟、肌肉組織都有LDH-C基因不同程度的表達(dá)，其表達(dá)量與相應(yīng)組織在中華鱉體內(nèi)的活動度有一定的線性關(guān)系，推測LDH-C基因的表達(dá)可增加產(chǎn)能。此外，在姚江水系中華鱉的肝臟中LDH-5占優(yōu)勢，而在日本品系中華鱉中卻沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象，這可能與日本中華鱉個體的脂肪含量較高有關(guān)（數(shù)據(jù)另文發(fā)表）。以上2個推測還有待進(jìn)一步研究驗證。

3.2 酯酶

酯酶（EST）是催化酯類化合物水解進(jìn)入中間代謝的重要水解酶，在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行最基本的生理功能[10]，其結(jié)構(gòu)多為單體，由1個亞基組成[4]。EST還能水解大量正常存在的非生理性酯類化合物，可能與機(jī)體的解毒功能有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，姚江水系中華鱉EST整體表達(dá)量低于日本鱉，猜測原因可能與中華鱉的生存環(huán)境有關(guān)。

酯酶并非生理性修飾酶，故可以EST酶譜作為遺傳指標(biāo)[14-15]。從酶譜整體的角度看，姚江水系中華鱉和日本品系中華鱉的EST酶譜均呈現(xiàn)組織特異性。 酯酶EST-4在日本品系中華鱉中表達(dá)而在姚江水系中華鱉中基本不表達(dá)，而姚江水系中華鱉腎臟中的酯酶EST-3表達(dá)量高于日本品系，且姚江水系中華鱉肝臟和腎臟中EST條帶數(shù)目多、活性強(qiáng)，具有種屬特異性，均可作為姚江水系中華鱉的種屬鑒定指標(biāo)。

3.3 谷氨酸脫氫酶

谷氨酸脫氫酶（GDH）是動物體內(nèi)參與谷氨酸新陳代謝的關(guān)鍵酶之一[12-15]，它以NAD、NADP或者同時利用兩者作為輔酶，參與到谷氨酸的合成與分解中，但在大多數(shù)生物體內(nèi)反應(yīng)是向著合成谷氨酸的方向進(jìn)行的[16]。目前水產(chǎn)動物同工酶GDH的研究少見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，GDH-3在日本品系中華鱉肌肉中不表達(dá)，而在姚江水系中表達(dá)，表明GDH-3的表達(dá)可能會導(dǎo)致某種生化途徑改變，從而影響生物的代謝途徑。由于谷氨酸是重要的鮮味氨基酸，故猜測GDH-3的高表達(dá)可能是姚江水系中華鱉與日本中華鱉相比味道更為鮮美的原因，但其相關(guān)性有待于進(jìn)一步確認(rèn)。GHD是氨基酸代謝中的重要酶類，尤其在非必需氨基酸的合成和轉(zhuǎn)化中起著重要作用[17]；因此GDH-3的表達(dá)是否直接影響氨基酸含量也有待于進(jìn)一步研究。

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