丙冬甘寧中藥方劑發(fā)酵前后成分的變化

范作良 劉英龍 鞠 雷 李汝春 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）賈慧卿 （濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司 山東 青州）

丙冬甘寧中藥方劑發(fā)酵前后成分的變化

范作良 劉英龍 鞠 雷 李汝春 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）
賈慧卿 （濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司 山東 青州）

丙冬甘寧中藥方經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵52h后，通過(guò)液相測(cè)定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后甘草次酸、黃芩素含量升高，而甘草酸和黃芩苷含量降低。

中藥 發(fā)酵 成分變化 質(zhì)量研究

肝臟作為動(dòng)物體內(nèi)重要而具有特殊功能的代謝器官，對(duì)體內(nèi)的代謝、消化、排泄、解毒以及免疫等過(guò)程具有重要作用。病毒、代謝毒物、藥物、各種理化因素等均可導(dǎo)致肝臟損傷或者肝功能障礙，動(dòng)物肝臟疾病的防治已經(jīng)成為當(dāng)前人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一［1］。近年來(lái)，由于各種因素導(dǎo)致肝臟疾病的頻發(fā)，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。微生物發(fā)酵的中藥產(chǎn)品與傳統(tǒng)中藥產(chǎn)品相比有起效快，用量少，有效成分含量高，并且可以減少中藥的不良?xì)馕兜葍?yōu)點(diǎn)。梔子，甘草，柴胡，五味子、丹參等中藥作為保肝藥物已經(jīng)有很長(zhǎng)的應(yīng)用歷史［2-6］，將這幾味藥組方為丙冬甘寧，利用芽孢桿菌將其發(fā)酵活化，本文對(duì)丙冬甘寧中藥方劑發(fā)酵前后成分的變化進(jìn)行分析，為臨床用藥提供依據(jù)。

1　材料

1.1供試藥品

中藥提取液由濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司提供；中藥發(fā)酵液由濰坊諾達(dá)藥業(yè)有限公司提供；甘草次酸對(duì)照品、黃芩素對(duì)照品、柴胡皂苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供；乙腈、色譜純由天津市大茂化學(xué)試劑廠提供；甲醇、優(yōu)級(jí)純由天津市福晨化學(xué)試劑廠提供；硅膠G板由青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)，批號(hào)080411。

1.2儀器

Agilent12000型高效液相色譜儀（四元泵、柱溫箱、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器由美國(guó)安捷倫公司生產(chǎn)）；Agilent ZORBOX SB-C18色譜柱（5μm，4.6mm× 150mm由美國(guó)安捷倫公司提供）；XS105十萬(wàn)分之一電子分析天平由瑞士梅特勒公司提供；WFH-204B便攜式紫外燈。

2　方法與結(jié)果

2.1發(fā)酵前后柴胡皂苷薄層分析變化

取中藥發(fā)酵液10ml、中藥提取液10ml，分別離心6000r/min，離心10min，取上清液，分別加乙醚15ml萃取3次，混合萃取液，在水浴中揮干乙醚，殘?jiān)?5%醇2ml使溶解，供點(diǎn)樣用。柴胡皂苷a，柴胡皂苷b，分別用95%的乙醇溶解，供點(diǎn)樣用。分別將提取液10μl，發(fā)酵液10ul和標(biāo)準(zhǔn)品溶液10ul點(diǎn)樣于同一薄層板上，展開(kāi)劑分別為氯仿：甲醇：水（70：25：5）展開(kāi)5cm，揮干溶劑，噴灑10%的硫酸加熱顯色。分別在可見(jiàn)光和365nm的在外觀下觀察，結(jié)果如圖1。

圖1　柴胡皂苷薄層分析結(jié)果

從薄層層析圖可以看出，中藥提取液和中藥提取發(fā)酵液中都存在柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的薄層點(diǎn)，提取液和發(fā)酵液中均存在2種成分，在中藥發(fā)酵液的薄層點(diǎn)中還存在2個(gè)明顯的點(diǎn)，跑在了柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的前面，說(shuō)明該物質(zhì)的極性比柴胡皂苷a和d的極性差，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，上述幾個(gè)物質(zhì)為柴胡皂苷的苷元。

2.2發(fā)酵前后甘草次酸含量變化

2.2.1色譜條件 色譜柱Chromsphere C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）、流相乙腈-水-甲醇（7：2：1）、流速0.8ml/ min、檢測(cè)波長(zhǎng)268nm、柱溫室溫、進(jìn)樣量20μl。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配置 精密稱取甘草次酸對(duì)照品約10mg，用甲醇適量超聲溶解，加甲醇至刻度，搖勻，配成甘草次酸對(duì)照品溶液。再精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml，置量瓶中，配成各個(gè)濃度的甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別取各個(gè)濃度的甘草次酸對(duì)照品溶液20μL，依次進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，記錄色譜圖及色譜峰面積，以進(jìn)樣量（μg）對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=1341206.1X+87543.5（相關(guān)系數(shù)r=0.9996），線性范圍為0.0768～1.2288μg。

圖2　甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4樣品處理方法 中藥提取液、發(fā)酵液的處理方法：分別取中藥提取液和發(fā)酵液10ml，加入5%的鹽酸20ml，搖勻10min，分別離心10min，6000r/min。取上清液10ml，用氯仿萃取3次，20ml/次。合并萃取液，蒸干，用甲醇溶解，定容到50ml容量瓶中。

2.2.5精密度試驗(yàn) 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣20μl，記錄吸收峰面積，測(cè)定結(jié)果RSD為0.22%。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試樣品溶液，室溫放置，每2h上樣1次，記錄鋒面積，測(cè)定結(jié)果RSD為1.87%。說(shuō)明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重現(xiàn)性試驗(yàn) 根據(jù)樣品處理方法，分別制備供試樣品，每個(gè)樣品制備6分。分別測(cè)定含量，測(cè)定結(jié)果藥渣的RSD為1.74%，發(fā)酵產(chǎn)物的RSD為1.58%。

2.2.8加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的提取液和發(fā)酵產(chǎn)物樣品，精密稱定5份，置于錐形瓶中，分別加入甘草次酸對(duì)照品溶液，分別處理樣品。測(cè)定樣品中甘草次酸含量，結(jié)果如表1、2。

表1　提取液加樣回收率 （mg、%）

表2　發(fā)酵液的加樣回收率 （mg、%）

2.2.9含量測(cè)定 按照設(shè)定的色譜條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，提取液和發(fā)酵產(chǎn)物中各3批產(chǎn)品中甘草次酸的含量，結(jié)果如表3。

表3　甘草次酸含量 （mg/ml）

2.3發(fā)酵前后黃芩苷、黃芩素的變化

2.3.1色譜條件 色譜柱Chromsphere C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）、流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（51：49）、檢測(cè)波長(zhǎng)277nm、流速1.0ml·min-1、柱溫25℃，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰，黃芩素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 黃芩苷對(duì)照品溶液制備：取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含25μg 黃芩苷的對(duì)照品溶液，搖勻，既得。黃芩素對(duì)照品溶液制備：取黃芩素對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含100μg 黃芩素的對(duì)照品溶液，搖勻，既得。

2.3.3供試樣品的制備 中藥提取液、發(fā)酵液的處理方法：分別取中藥提取液和發(fā)酵液，分別離心10min，6000r/min。取上清液5ml，轉(zhuǎn)移置于25ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇5ml超聲溶解，加入無(wú)水乙醇定容。從容量瓶中移取5ml至50ml容量瓶中，用70%的乙醇定容。

2.3.4檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 黃芩苷與黃芩素對(duì)照品經(jīng)DAD檢測(cè)器進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，二者均在277nm處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為277nm。

2.3.5專屬性試驗(yàn) 按處方比例配制缺黃芩的陰性樣品，制備樣品溶液，根據(jù)色譜條件測(cè)定，結(jié)果黃芩苷和黃芩素對(duì)照峰處均未出現(xiàn)色譜峰，說(shuō)明發(fā)酵液和提取液中其他成分對(duì)黃芩中黃芩苷和黃芩素的測(cè)定均無(wú)干擾。

2.3.6線性關(guān)系考察 （1）黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取黃芩苷對(duì)照品4.08mg，置100ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為40.8μg/ml的溶液。分別稀釋成濃度為10.2、15.3、20.4、25.5、30.6、35.7μg/ml。精密吸取上述6個(gè)濃度對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：黃芩苷在0.102～0.357μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程Y=33309.29X+2233.611（r=0.9999）。結(jié)果見(jiàn)圖3。（2）黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取黃芩素對(duì)照品13.43mg，置25ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為0.537mg/ml的溶液。分別稀釋成濃度為53.7、107.4、214.8、322.2、429.6、537.0μg/ml。精密吸取上述6個(gè)濃度對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：黃芩素在0.537 ～5.370μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=51392.68X-666.28（r=0.9998）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3　黃芩苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4　黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 制備供試品溶液，室溫下放置，分別于0、1、2、4、6、8、10、12、24h后依次注入液相色譜儀，測(cè)定黃芩苷與黃芩素的峰面積并計(jì)算RSD值。黃芩苷與黃芩素的RSD分別為0.22% 和0.52%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.8精密度試驗(yàn) 取樣品，制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值并計(jì)算RSD值。黃芩苷和黃芩素的RSD分別為0.26%和0.53%，結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.3.9重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，制備供試品溶液6份，測(cè)定其含量及RSD值。黃芩苷和黃芩素的含量分別為1.31mg/g（RSD=1.09%），8.43mg/g（RSD =0.48%）。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.10回收率試驗(yàn) （1）黃芩苷回收率試驗(yàn)：稱取已知含量的同一批供發(fā)酵液和提取液各1ml（5份），精密稱定，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品，測(cè)定黃芩苷含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4、5。（2）黃芩素回收率試驗(yàn)：稱取已知含量的同一批發(fā)酵液1ml（5份），精密稱定，分別精密加入黃芩素對(duì)照品，測(cè)定黃芩素含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表6、7。

表4　發(fā)酵液中黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （mg、%）

表5　提取液中黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （mg、%）

表6　發(fā)酵液中黃芩素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果 （mg、%）

2.3.11黃芩苷、黃芩素在發(fā)酵液和提取液中的含量 分別取3批中藥發(fā)酵液和提取液各2ml，處理樣品，進(jìn)入高效液相，測(cè)定含量。

表8　黃芩苷在發(fā)酵液和提取液中的含量

表9　黃芩素在發(fā)酵液和提取液中的含量 （mg/ml）

3　結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，發(fā)酵液和提取液中均有柴胡皂苷a，柴胡皂苷d的薄層特征，并且發(fā)酵液中的薄層點(diǎn)要比提取液多兩個(gè)，并且特有的斑點(diǎn)移動(dòng)距離大于柴胡皂苷a和d，這說(shuō)明這兩種物質(zhì)的極性、分子量小于柴胡皂苷，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，這兩種物質(zhì)疑似柴胡皂苷a和d的苷元。從液相測(cè)定的甘草次酸、黃芩素、甘草酸、黃芩苷的含量來(lái)看，通過(guò)發(fā)酵后甘草次酸、黃芩素含量升高，而甘草酸和黃芩苷含量降低，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸和甘草酸的區(qū)別就是，甘草次酸比甘草酸少了一個(gè)葡萄糖，而黃芩苷和黃芩素的區(qū)別也是如此，黃芩素、甘草次酸、柴胡皂苷苷元，在腸道內(nèi)可以不經(jīng)過(guò)腸道微生物的分解，直接吸收進(jìn)入血液，藥效要比黃芩苷、甘草酸、柴胡皂苷快，因此，通過(guò)生物發(fā)酵提高了中藥的藥效，加快了中藥的作用速度。

［1］ 王麗宏， 吉紅， 張寶彤等. 中草藥保肝作用的研究進(jìn)展［J］. 飼料博覽， 2012， 11： 41-45.

［2］ 胡元亮. 中獸醫(yī)學(xué)［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2006.

［3］ 劉鐘杰， 許劍琴. 中獸醫(yī)學(xué)［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2010.

［4］ 鐘秀會(huì)， 劉占民. 獸醫(yī)中藥學(xué)［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2009.

［5］ 汪德剛. 獸醫(yī)中藥學(xué)［M］. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社， 2008.

［6］ 李時(shí)珍. 本草綱目［M］. 北京： 華夏夏出版社.

S853.92

A

1007-1733（2015）06-0009-03