重組質粒pEGFP-N1-apoJ的構建及在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達*

周沖，劉學良，鄭曉梅，劉亮（四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 .神經外科，.神經內科，四川 瀘州 646000）

重組質粒pEGFP-N1-apoJ的構建及在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達*

周沖1，劉學良1，鄭曉梅2，劉亮1
（四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1.神經外科，2.神經內科，四川 瀘州 646000）

目的體外構建重組質粒pEGFP-N1-apoJ，轉染大鼠骨髓間充質干細胞，并檢測其在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達。方法通過脂質體介導重組質粒pEGFP-N1-apoJ轉染大鼠骨髓間充質干細胞，確定轉染效率，并通過Real-time PCR、免疫細胞化學法、Western blot法檢測載脂蛋白-J（apoJ）的表達。結果增強型綠色熒光蛋白在大鼠骨髓間充質干細胞中瞬時轉染效率達35%。轉染后Real-time PCR、免疫細胞化學法和Western blot法檢測證實重組質粒pEGFP-N1-apoJ在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達。結論重組質粒pEGFPN1-apoJ成功轉染大鼠骨髓間充質干細胞，并在大鼠骨髓間充質干細胞中得到表達，有助于應用apoJ行基因治療，為進一步研究apoJ作為新的腦出血治療措施奠定實驗基礎。

載脂蛋白-J（apoJ）；重組質粒；基因轉染；骨髓間充質干細胞

載脂蛋白-J（apolipoprotein J，apoJ，又稱clusterin）是一種幾乎所有類型的細胞都能分泌的多功能糖蛋白。在血漿中apoJ與高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）相關，尤其與含有ApoAI和膽固醇轉移蛋白活性的HDL亞型聯系最密切。在損傷組織中，apoJ基因表達升高，是一種退化或損傷組織中基因轉錄上行調節(jié)的蛋白，參與組織損傷的修復。相關研究表明，補體系統(tǒng)介入腦出血后的神經元死亡，而apoJ作為一個明確的補體調節(jié)因子，通過抑制腦出血后的補體激活阻止補體介導的神經元死亡，使apoJ作為新的腦出血的治療措施成為可能。本研究旨在建立apoJ基因的體外真核細胞表達系統(tǒng)，為進一步研究高表達apoJ基因的骨髓間充質干細胞移植治療腦出血疾病奠定實驗基礎。

1　材料與方法

1.1主要材料及試劑

實驗動物：清潔級（SD）大鼠，體重80～100 g，由四川醫(yī)科大學動物中心提供。

試劑：α-MEM培養(yǎng)基；胎牛血清（Gibco公司），脂質體LipofectaminTM2000（Invitrogen公司），兔抗鼠apoJ抗體（Bioworld Technology公司），正反向引物（上海生物工程有限公司），總RNA提取試劑盒，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（Solaria公司），兔抗鼠apoJ抗體（Proteintech公司），Anti-GAPDH，二抗-羊抗兔IgG（Bios公司），10～170 kD電泳蛋白彩色預Marker（Thermo公司），ECL發(fā)光液（Millipore公司），重組質粒pEGFP-N1-apoJ和空質粒pEGFP-N1由上海生工完成并提供。

1.2大鼠骨髓間充質干細胞的培養(yǎng)

大鼠骨髓間充質干細胞由四川醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室贈送，采用貼壁培養(yǎng)法。

1.3脂質體介導重組質粒pEGFP-N1-apoJ和空質粒pEGFP-N1瞬時轉染大鼠骨髓間充質干細胞

胰蛋白酶消化第3代大鼠骨髓間充質干細胞，以5～6×106接種于6孔板中，細胞接種到6孔板融合達90%以上時即可進行轉染，轉染前1天換液。轉染前將6孔板中的細胞用無血清培養(yǎng)基沖洗2遍，加入2 ml無血清培養(yǎng)基。轉染實驗分為A組、B組和C組，A組為實驗組，用質脂體LipofectamineTM2000進行pEGFP-N1-apoJ轉染；B組為實驗對照組，轉染空質粒pEGFP-N1；C組為空白對照組，加入等量質脂體，其他步驟均相同。各組所用脂質體量相等，A組所用重組質粒pEGFP-N1-apoJ的量與B組所用空質粒pEGFP-N1的量相等。轉染后在37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，6 h后更換含有血清無雙抗的全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉染24 h后，于熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，并利用流式細胞儀分別測定轉染后1 d、2 d、3 d和5 d時的表達效率。

1.4重組質粒pEGFP-N1-apoJ攜帶的目的基因apoJ在大鼠骨髓間充質干細胞中表達的檢測

采用Real-time PCR法檢測重組質粒pEGFPN1-apoJ攜帶的目的基因apoJ在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達，轉染72 h后，分別收集A組、B組和C組細胞，一步法提取各組細胞總RNA，行逆轉錄，用先前設計的正反向引物（見附表），通過Real-time PCR法檢測apoJ基因的表達，并行各組PCR產物2%瓊脂糖凝膠電泳分析。Real-time PCR條件為：Stage 1：預變性95℃、30 s，1個循環(huán)，Stage 2：PCR反應95℃、5 s，58℃、34 s，共40個循環(huán)。

附表　apoJ及GAPDH mRNA的引物序列

1.5免疫細胞化學法檢測apoJ蛋白的表達

轉染72 h后，取出3組細胞爬片。經4%多聚甲醛固定，用3%過氧化氫處理，滴加5%BSA，37℃孵育20 min，去血清，滴加兔抗鼠apoJ抗體（1∶100），4℃過夜。加二抗，37℃孵育30 min；上述各操作步驟之間均用PBS振蕩洗滌。最后用DAB顯色，常規(guī)脫水、封片，顯微鏡下觀察。

1.6利用Western blot法檢測apoJ蛋白的表達

轉染72 h后，分別收集3組細胞，行貼壁細胞蛋白提取。利用Western blot法進行檢測apoJ蛋白的表達，制膠，上樣行SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜，封閉，孵兔抗鼠apoJ一抗（1∶1 000）4℃過夜，孵山羊抗兔二抗1 h，暗室內曝光，顯影、定影。

2　結果

2.1大鼠骨髓間充質干細胞的形態(tài)學觀察

光學顯微鏡下觀察，大鼠骨髓間充質干細胞未貼壁時為圓形單核細胞，折光性強。12～24 h后開始貼壁，貼壁后形態(tài)發(fā)生改變，變?yōu)槎嘟切魏捅馄叫?。培養(yǎng)10～14 d培養(yǎng)板孔內即可達90%融合，形態(tài)變?yōu)殚L梭形為主（見圖1）。第5～6代后細胞形態(tài)趨于穩(wěn)定相同，擠壓成束狀，漩渦狀，細胞胞漿豐富，核大，核仁也較明顯。

2.2脂質體介導質粒對大鼠骨髓間充質干細胞瞬時轉染

經脂質體LipofectamineTM2000介導轉染24 h后，由于脂質體本身的細胞毒性，造成3組細胞均出現少量呈懸浮狀的絮狀物，經換液去除這些死細胞后未再發(fā)生上述現象。轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察，A組和B組均有較多的細胞出現綠色熒光，C組細胞未見熒光。綠色熒光多見于折光性強、處于分裂期的細胞；綠色熒光強弱不均，提示基因轉入的拷貝數略有差異。至轉染后72 h綠色熒光最明顯（見圖2），以后無明顯改變，5 d以后綠色熒光呈逐漸下降趨勢。利用流式細胞儀測定EGFP在第1、2、3、5天對骨髓間充質干細胞的轉染效率分別為28.60%、31.67%、34.62%和15.32%。

2.3重組質粒pEGFP-N1-apoJ攜帶的目的基因apoJ在大鼠骨髓間充質干細胞中的表達

轉染72 h后，經Real-time PCR擴增后，3組細胞均有不同程度的apoJ mRNA表達，但A組細胞apoJ mRNA表達量明顯高于其他兩組，提示A組細胞除細胞本身內源性apoJ基因表達外，同時存在pEGFP-N1-apoJ攜帶的外源性目的基因apoJ表達（見圖3）。Real-time PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，A組、B組和C組細胞均在129 bp處有一特異性擴增條帶，提示均有apoJ基因轉錄，應用Ea-gle EyeⅡ型圖像分析處理系統(tǒng)對電泳帶進行掃描，根據各條帶光密度值，計算各組apoJ mRNA表達的相對水平，結果提示A組細胞apoJ mRNA表達水平明顯高于其他兩組（見圖4）。

2.4轉染后3組細胞經免疫細胞化學法檢測apoJ蛋白的表達

轉染72 h后，3組細胞爬片經免疫細胞化學法檢測，A組陽性細胞率明顯高于其他兩組。提示A組細胞轉染外源性目的基因apoJ后，外源性目的基因apoJ得到高效的轉錄和翻譯（見圖5）。

2.5轉染后 3組細胞經 Western blot法檢測apoJ蛋白的表達

轉染72 h后，3組細胞利用Western blot進行檢測apoJ蛋白的表達，A組細胞可見apoJ蛋白大量表達，B、C組細胞見apoJ蛋白微量表達，利用quantity one軟件進行條帶灰度值分析，結果表明A組細胞apoJ蛋白表達量明顯高于B、C組細胞。提示A組細胞轉染外源性目的基因apoJ后，外源性目的基因apoJ得到高效的轉錄和翻譯（見圖6）。

圖1　MSCs原代培養(yǎng)10～14 d（×100）

圖2　轉染72 h時熒光顯微鏡觀察 （×100）

圖3　轉染72 h時 Real-time PCR

圖4　轉染72 h時Real-time PCR擴增產物電泳

圖5MSCs轉染p-EGFP-N1-apoJ 72 h細胞免疫組織化學 （×400）

圖6　Western blot檢測轉染72 h時apoJ的表達

3　討論

apoJ是一種雜二聚體糖蛋白，由兩個亞單位α 和β鏈組成，相對分子質量為70 000。廣泛分布于各種組織和體液中［1-3］，人apoJ mRNA在腦組織中濃度最高，依次分別為睪丸、卵巢、肝、心和肺，在脾、乳腺和膀胱中含量最少。apoJ在多種神經系統(tǒng)疾病中均有高表達［4］，在神經系統(tǒng)疾病中的作用日益受到重視。相關研究表明［5-6］，apoJ具有抑制細胞凋亡、參與補體調節(jié)抑制炎癥反應、參與脂質代謝等多種生理功能。補體激活引起的炎癥反應和細胞凋亡在腦出血后繼發(fā)性損傷中的作用日益受到重視［7］，炎癥反應和細胞凋亡是腦出血疾病重要的病理生理機制，抑制炎癥反應和細胞凋亡成為治療腦出血的新方法［8］。有關apoJ保護神經細胞的具體機制目前尚未明確，CALERO等［9］的研究表明：腦損傷后apoJ濃度上調是對神經元的一種保護反應，主要有4種機制：①apoJ可作為反凋亡信號；②抑制補體形成膜攻擊復合物，從而抑制炎癥；③apoJ具有抗氧化作用；④和部分炎癥相關蛋白結合，抑制這些蛋白導致的炎癥反應。apoJ與阿爾茨海默病、前列腺癌和乳腺癌的相關研究報道較多，而與腦血管疾病的研究報道不多。相關研究表明，apoJ還具有促進神經元分化和營養(yǎng)神經元的作用［10］，亦有利于神經元的可塑性［11］。

MSCs最早是由FRIEDENSTEIN等［12］從骨髓中分離培養(yǎng)出來，是一種具有多向分化潛能的原始細胞，在特定環(huán)境下可分化為所在組織的表型細胞。骨髓間充質干細胞可分化為多種細胞，如骨細胞、肌腱細胞、脂肪細胞、神經細胞和神經膠質細胞［13-14］。KOPEN等［15］首次報道將骨髓間充質干細胞注入新生鼠側腦室可以分化為神經元和神經膠質細胞。有關研究表明骨髓間充質干細胞可以誘導分化為特定類型和有功能的神經元［16-18］，并且通過獨立的調節(jié)機制完成向神經元分化［19］。骨髓間充質干細胞有類似神經干細胞的多向分化潛能，但又有其他干細胞沒有的特性，使其成為干細胞移植治療中樞神經系統(tǒng)損傷的理想細胞供體和轉基因的細胞載體［20-22］。干細胞移植治療中樞神經系統(tǒng)損傷，使損傷軸突再生、突觸重建和恢復部分功能成為可能，骨髓間充質干細胞除了具有干細胞的一般特性外，還具有取材方便、不涉及倫理問題、易于外源基因轉染及穩(wěn)定表達、免疫原性弱、可進行自體移植等優(yōu)點，被認為是一種細胞替代治療及基因治療的理想靶細胞［23］。另外，有研究表明骨髓間充質干細胞可分泌多種細胞因子，發(fā)揮抗凋亡、抗炎，促進腦損傷組織內源性修復等作用［24-25］。

THAMBISETTY等［26］研究提示apoJ具有保護神經元的作用，本研究通過構建重組質粒pEGFP-N1-apoJ轉染大鼠骨髓間充質干細胞，嘗試建立apoJ基因修飾的骨髓間充質干細胞體系，為后續(xù)進一步研究apoJ的作用機制及進一步為臨床基因工程干細胞移植治療腦出血提供一定的理論基礎。本研究通過脂質體介導pEGFP-N1-apoJ對大鼠骨髓間充質干細胞進行轉染，經實時定量PCR、免疫細胞化學及Western blot檢測，apoJ在骨髓間充質干細胞中得以轉錄和翻譯，說明攜帶外源性apoJ基因的骨髓間充質干細胞構建成功?；谏鲜鲈颍捎帽磉_外源性apoJ的骨髓間充質干細胞移植治療腦出血，可以產生雙重作用：一方面，外源性攜帶apoJ基因骨髓間充質干細胞能分化為神經元和神經膠質細胞，以補充腦出血后腦損傷丟失的細胞，在結構上修復和重建神經環(huán)路；另一方面，攜apoJ基因骨髓間充質干細胞分泌高水平的apoJ可以改善腦出血部位及周圍組織的微環(huán)境，并通過多種途徑抑制炎癥反應及神經細胞凋亡，促進受損神經元和神經膠質細胞的功能恢復。本研究提示攜外源性apoJ基因骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)構建成功，并且外源性目的基因apoJ得到高水平表達，為進一步開展攜apoJ基因骨髓間充質干細胞移植治療腦出血的實驗提供一定的實驗基礎和理論依據，希望能夠成為新的腦出血疾病治療措施。

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（張蕾 編輯）

Construction of recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ and its expression in rat bone marrow
mesenchymal stem cells in vitro*

Chong ZHOU1，Xue-liang LIU1，Xiao-mei ZHENG2，Liang LIU1
（1.Department of Neurosurgery，2.Department of Neurology，the Affiliated Hospital，Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，P.R.China）

【Objective】To construct recombinant plasmid pEGFP-N1-apolipoprotein J（apoJ），transfect it into rat bone marrow mesenchymal stem cells（MSCs），and detect its expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro.【Methods】Rat bone marrow MSCs were transiently transfected with the recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ and the transfection efficiency of green fluorescent protein（GFP）was determined. Real-time PCR，Western blot and immunocytochemistry analysis were also performed for detection of apoJ expression in rat bone marrow MSCs.【Results】Transient transfection efficiency reached 35%.After transfection，the transcription of apoJ was detected in MSCs and the expression of apoJ protein was also verified. 【Conclusions】Recombinant plasmid pEGFP-N1-apoJ has been successfully constructed，transfected into rat bone marrow MSCs and expressed in rat bone marrow MSCs.This procedure may be helpful for the application of apoJ to gene therapy and provide the experimental basis for the further study of apoJ as a new treatment of cerebral hemorrhage.

apolipoprotein J（apoJ）；recombinant plasmid；gene transfection；bone marrow mesenchymal stem cell

R-332

A

1005-8982（2015）33-0015-05

2015-06-26

四川省衛(wèi)生廳課題基金（No：110597）

劉亮，E-mail：liulst@163.com；Tel：15348216516