超聲波法輔助提取荸薺塊莖皮中甾醇的工藝研究

盧敏等

摘要：采用超聲波法提取荸薺[Heleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.]塊莖皮中的甾醇，對提取溶劑的種類、溶劑體積分數(shù)、料液比、提取時間、超聲波功率分別進行單因素試驗，并在此基礎(chǔ)上利用Box-Benhnken中心組合試驗和響應(yīng)面分析法確定了植物甾醇提取的最佳工藝。結(jié)果表明，荸薺塊莖皮中甾醇的最佳提取工藝條件為60%乙醇、料液比為1∶40（g∶mL）、提取時間為14 min、超聲波功率為600 W，實際測得的植物甾醇的紫外吸光度為1.375。

關(guān)鍵詞：荸薺[Heleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.]；超聲波；甾醇；響應(yīng)面法

中圖分類號：S645.3；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）12-2987-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.047

Study on Phytosterols Extraction from Chufa Tubers Leather by Ultrasonic Method

LU Min，YANG Zhi-gang， LUO Bing，SUN Hai-yan

（Department of Bioengineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500， Jiangsu，China）

Abstract：Using the method of ultrasonic to extract phytosterols from chufa tubers leather， based on single factor experiment， the factors which affected the amount of phytosterols including extraction solvent， alcohol concentration， the ratio of solid to liquid， extraction time and ultrasonic power were studied by Box-Benhnken center combination experiment and the response surface method. The results showed that the best technological conditions of phytosterols extraction from chufa tubers leather were alcohol concentration 60%， the ratio of solid to liquid 1：40， extraction time 14 min， and ultrasonic power 600W. Under the conditions， the ultraviolet spectrophotometer absorbance was 1.375.

Key words： Chufa； ultrasonic；Phytosterols； response surface method

荸薺[Heleocharis dulcis （Burm. f.） Trin.]屬莎草科（Cyperaceae）多年生水生草本植物，生長于池沼中或栽培在水田里。具匍匐莖，先端膨大為球莖。古稱鳧茨，又稱烏芋、馬蹄、地栗，是中國典型的傳統(tǒng)中藥，具有藥膳同源之功效，不僅質(zhì)脆味佳，營養(yǎng)豐富，而且能清心降火、補肺涼肝、消食化痰、破積滯、利膿血等。《中藥大辭典》上記載荸薺中含有抑菌成分-馬蹄英，該物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及產(chǎn)氣桿菌均有抑制作用[1]。還有報道發(fā)現(xiàn)荸薺的各種制劑在動物體內(nèi)均有抑制腫瘤細胞生長的作用[2]。

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷全氫菲為骨架的天然醇類化合物。天然植物甾醇種類繁多，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜子甾醇和菜油甾醇4種無甲基甾醇[3]。植物甾醇主要存在于油脂中，特別是精煉油后的脫臭餾出物中含量較大，所以在大多數(shù)已報道的研究中，一般都以脫臭餾出物作為提取原料，用不同的方法加以提取[4-8]。甾醇屬天然物質(zhì)，本身無毒性，且具有乳化性和穩(wěn)定性等特點，因此在醫(yī)藥、食品、化妝品、動物生長劑、植物生長激素及化工、紡織等領(lǐng)域都得到廣泛應(yīng)用[9]。植物甾醇提取方法有多種，常見的提取方法有溶劑結(jié)晶法、絡(luò)合法、皂化法、蒸餾法（簡單蒸餾法、分子蒸餾法）、吸附法（柱吸附法、高壓流體吸附法）、超臨界CO2萃取法、酶法等[10，11]。近年來也有使用超聲波法提取植物甾醇的研究報道[12，13]。本研究采用超聲波法提取荸薺塊莖皮中的植物甾醇并確定其最佳工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荸薺：產(chǎn)地為蘇州，購于農(nóng)貿(mào)市場；植物甾醇混合標準品：上海奧宇生物科技有限公司；無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚（均為分析純）；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器設(shè)備

LP502B型電子天平、TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用器材有限公司）、DFT-200型高速中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司制造）、FQ-IID型超聲波細胞粉碎機（南京菲齊工貿(mào)有限公司）、202-3型烘箱（上海實驗儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理 將荸薺洗凈削皮，將皮烘干粉碎備用。

1.3.2 最大波長的測定 精確稱取20 mg植物甾醇混合標準品，用無水乙醇溶解并定容至25 mL容量瓶，以無水乙醇為空白對照，檢測植物甾醇混合標準品的最大紫外吸收波長。

1.3.3 荸薺塊莖皮中植物甾醇的提取 準確稱取荸薺塊莖皮粉末0.5 g，用一定濃度的提取溶劑以一定的料液比在一定的超聲波功率條件下提取一定時間后過濾，在50 mL容量瓶內(nèi)用相應(yīng)濃度的提取溶劑將濾液定容至50 mL，于檢測的最大紫外吸收波長處測定其吸光度。

1.3.4 最佳提取溶劑的確定 在超聲波提取條件下，選取幾種常用溶劑進行比較試驗。固定條件：提取時間60 min，料液比1∶20（g∶mL，下同），超聲波功率600 W。在超聲波提取條件下，選用無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、石油醚進行提取，確定最佳提取溶劑。

1.3.5 單因素試驗 精確稱取荸薺塊莖皮粉末0.5 g，以“1.3.4”確定的最佳溶劑為提取溶劑，分別考察不同體積分數(shù)的提取溶劑（50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）；提取時間（5、10、15、20、25 min）；超聲波功率（200、300、400、500、600 W）對植物甾醇提取的影響。

1.3.6 響應(yīng)面法試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，以紫外吸光度為響應(yīng)值，選取對甾醇提取影響較大的單因素進行響應(yīng)面試驗，通過回歸方程和方差分析確定最佳提取工藝，并對最佳條件進行驗證試驗。統(tǒng)計分析軟件為Design-Expert 7.0專業(yè)版本。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 最佳提取溶劑的選擇 4種提取溶劑對吸光度的影響見圖1。由圖1可知，以無水乙醇作為提取溶劑時，荸薺塊莖皮中植物甾醇的提取量最高，吸光度達到0.497，其次是正己烷，其吸光度為0.217，兩者相差較大，故將無水乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 乙醇體積分數(shù) 乙醇體積分數(shù)對荸薺塊莖皮中植物甾醇提取的影響見圖2。由圖2可知，當乙醇體積分數(shù)小于60%時，植物甾醇的吸光度隨著乙醇體積分數(shù)的增大而增大，而當乙醇的體積分數(shù)大于70%時，植物甾醇的吸光度隨著乙醇體積分數(shù)的增大而減小。這是由于不同體積分數(shù)的乙醇極性和揮發(fā)性不同，植物甾醇具有活性基團—羥基，能與乙醇和水形成氫鍵，而當乙醇體積分數(shù)太大時，乙醇揮發(fā)損耗大，吸光度會降低。

2.1.3 料液比 料液比對荸薺塊莖皮中植物甾醇提取的影響見圖3。由圖3可知，當料液比大于1∶40時，植物甾醇的吸光度隨著料液比的降低而增大，這主要是由于隨著料液比的降低，荸薺塊莖皮粉末被稀釋，植物甾醇就容易滲透出來；但是當料液比小于1∶40時，植物甾醇的吸光度卻隨著料液比的降低而減少，這主要是因為受試驗條件所限，超聲波提取時燒杯口是敞開的，料液比降低，溶劑損耗增大，所以提取量減少，因此，確定最佳料液比為1∶40。

2.1.4 提取時間 超聲提取時間對荸薺塊莖皮中植物甾醇提取的影響見圖4。由圖4可知，當超聲波提取時間小于15 min時，超聲波提取時間越長，植物甾醇的吸光度就越大，但當超聲波提取時間超過15 min后，隨著超聲提取時間的延長，植物甾醇的吸光度反而下降，這是由于隨著時間的延長，超聲波提取使得乙醇的損耗增加，另一方面也是由于乙醇的揮發(fā)導(dǎo)致的損耗。因此超聲波提取時間應(yīng)選擇在15 min左右。

2.1.5 超聲波功率 超聲波功率對荸薺塊莖皮中植物甾醇提取的影響見圖5。由圖5可知，當超聲波功率小于500 W時，超聲波功率越大，植物甾醇的吸光度就越大，這是因為超聲波功率越大，細胞分子運動加劇，加速了有效成分的溶解和釋放，所以植物甾醇的吸光度增大，但當超聲波功率大于500 W時，隨著超聲波功率的增大，植物甾醇的吸光度反而下降，這或許是因為超聲波功率增大溶解的雜質(zhì)的含量也相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致有效成分的提取量下降。

2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果

2.2.1 方程擬合 單因素試驗結(jié)果表明，料液比、提取時間、超聲波功率對荸薺塊莖皮中植物甾醇的提取有顯著影響。因此，固定乙醇體積分數(shù)為60%，通過響應(yīng)面分析對料液比、超聲波時間、超聲波功率3個因素進行更深入的研究。分析因素與水平設(shè)計見表1，響應(yīng)面分析方案及試驗結(jié)果見表2。通過試驗軟件Design-Expert 7.0將表2的結(jié)果進行擬合，得到了按實際值計的擬合方程：

Y=-3.232 30+0.145 53A+0.177 12B+0.001 57C+0.000 455AB+0.000 019 2AC-0.000 008 5BC-0.002 062 25A2-0.006 909B2-0.000 001 722 5C2。試驗的方差分析見表3。由表3可知，方程的F值為5.00，F(xiàn)>f0.05（9，7）=3.29，說明因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著；模型的R2=0.963 8，說明擬合程度較高，即試驗方法是可靠的。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，對結(jié)果的影響排序為料液比<超聲波功率<提取時間。用超聲波法提取荸薺塊莖皮植物甾醇的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)為60%，料液比1∶39.6，提取時間為13.7 min，超聲功率為600 W，理論吸光度為1.383。

2.2.2 響應(yīng)面圖 響應(yīng)曲面及其等高線見圖6至圖8。由圖6至圖8可看出，3個響應(yīng)面均為開口向下的凸曲面， 3個因素與甾醇吸光度呈拋物線關(guān)系，且在考察范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的極值。采用上述最優(yōu)提取條件進行荸薺塊莖皮中植物甾醇提取試驗，同時考慮到實際操作的便利，將條件修正為乙醇體積分數(shù)為60%、料液比為1∶40、提取時間為14 min、超聲波功率為600 W，實際測得提取的植物甾醇紫外吸光度為1.375，與理論預(yù)測值相比，相對誤差是0.58%。因此，采用該法優(yōu)化得到的工藝條件參數(shù)準確可靠，具有使用價值。

3 小結(jié)

60%的乙醇為超聲波提取荸薺塊莖皮中植物甾醇的理想溶劑，響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件：料液比為1∶40，提取時間為14 min，超聲功率為600 W，0.5 g荸薺塊莖皮粉末提取的植物甾醇的紫外吸光度達到1.375，與理論值相對誤差為0.58%。

參考文獻：

[1] 劉 欣，趙力超，周愛梅.荸薺產(chǎn)粉廢漿中功能組分及其功能效果的初步研究[J].食品科學(xué)，2006，27（2）：251-255.

[2] 盛繼群.孝感荸薺種質(zhì)資源及應(yīng)用價值[J].氨基酸和生物資源，2002，24（3）：11-13.

[3] 諸愛士，李盧川.響應(yīng)面優(yōu)化菜籽毛油甾醇提取[J].中國糧油學(xué)報，2011，26（7）：63-67.

[4] 劉 亮，楊 根.皂化酸解法提取菜籽油脫臭餾出物中植物甾醇的工藝研究[J].浙江化工，2008，39（9）：1-5.

[5] 姜洪峰，錢俊青.菜籽油脫臭餾出物中天然VE和植物甾醇提取工藝研究[J].中國糧油學(xué)報，2007，22（3）：115-121.

[6] 姜紹通，邵 平，潘麗軍.菜籽油脫臭餾出物中甾醇分離的甲酯化過程優(yōu)化研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2006，22（2）：164-167.

[7] 李 脈，王艦平.脫臭餾出物酶法制備植物甾醇酯的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：96-99.

[8] 高 晶.脫臭餾出物中甾醇的提取與精制工藝研究[J].華南理工大學(xué)報，2004，21（1）：49-53.

[9] 周寶蘭.植物甾醇的應(yīng)用[J].中國油脂，1992，17（4）：33-38.

[10] THOMAS S C，THOMAS H J，JOHN C G.Phytosterol contene of sea buckthorn（Hippophae mamnoides L.） seed oil：Extraction and identification[J]. Food Chemistry，2007，101：1633-1639.

[11] 龐利蘋，徐雅琴.植物甾醇提純及單體分離工藝的研究進展[J].中國糧油學(xué)報，2010，25（3）：124-128.

[12] 張澤生，于衛(wèi)濤.超聲波法提取米糠中植物甾醇的工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（1）：43-46.

[13] 陳紅梅.超聲波法提取紅曲中麥角甾醇的條件優(yōu)化研究[J].安徽農(nóng)學(xué)通報，2007，13（7）：84-85.