牛倩雅 辛 佳 王晶珊 楊 煜 李廣存 郭寶太*
(1青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,山東青島 266109;2山東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所,山東濟南 250100)
馬鈴薯卷葉病毒(Potato leafroll virus,PLRV)是黃癥病毒科(Luteoviridae)成員,可引起馬鈴薯葉片縱向卷曲等癥狀,導致減產(chǎn),引起品種退化,危害非常嚴重。馬鈴薯病毒粒體提取、純化困難,PLRV的分布局限于寄主植株的維管束內(nèi),含量低,提取純化尤其困難。我國自主研制的PLRV抗血清缺乏,遠遠不能滿足其研究與脫毒種苗生產(chǎn)中對PLRV進行ELISA檢測的需求。
PLRV-CP基因長度為627 bp,在我國6種馬鈴薯主要病毒中,其CP基因是最小的,但該基因密碼子組成特別,原核表達非常困難,是利用原核表達重組CP制備PLRV特異性抗血清的障礙。PLRV-CP基因原核表達的困難可通過不同的技術(shù) 途 徑 克 服(Lopez et al.,1994;Pichova et al.,2011)。青島農(nóng)業(yè)大學遺傳研究室通過刪除抑制翻譯的126 bp片段,實現(xiàn)了其突變基因的高效原核表達,并利用重組CP制備出了PLRV抗血清(隋炯明 等,2012),且獲得的抗體與酶標抗體可用于PLRV的DAS-ELISA檢測(李楠楠 等,2011),為大量組裝PLRV的ELISA試劑盒奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
與病毒粒體作抗原相比,重組CP途徑具有抗原制備效率高、純度高,沒有病毒擴散的潛在危害等優(yōu)點。目前大多采用變性的重組蛋白作抗原制備馬鈴薯病毒抗血清,變性蛋白不具有天然的構(gòu)象,與病毒粒體的抗原決定簇會存在差異。本試驗目的是建立PLRV-CP基因水溶性原核表達體系,為利用水溶性重組CP制備出檢測能力更強的PLRV抗血清奠定基礎(chǔ)。
分子伴侶原核表達質(zhì)粒、冷激誘導原核表達載體pColdⅠ與pMD18-T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司。PLRV-CP突變基因的原核表達載體pBAD-LRCP-126由本實驗室構(gòu)建(隋炯明 等,2012),簡寫為pBAD-LRCP,該基因受PBAD啟動子驅(qū)動表達。大腸桿菌菌株DH5α、BL21(DE3)、TOP10由本實驗室保存。
DNA marker、限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶、T4 DNA 連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司,質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。溶菌酶、蛋白酶抑制劑PMSF購自Sigma公司。
PLRV-CP基因的擴增引物P1的序列為:5′-CATATGAGTACGGTCGTGG -3′(含NdeⅠ酶切位點);P2:5′-AAGCTTTTTGGGGTTTTGCAA-3′(含Hind Ⅲ酶切位點),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
分別用5種可表達出分子伴侶的質(zhì)粒(表1)轉(zhuǎn)化重組菌TOP10(pBAD-LRCP),獲得既含pBAD-LRCP又含分子伴侶原核表達載體的轉(zhuǎn)化子。
將5種轉(zhuǎn)化子分別在37 ℃,Amp終濃度100 μg·mL-1,Cm終濃度50 μg·mL-1的液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),在OD600值達到0.6~0.9時,加入合適的誘導物使PLRV-CP基因與分子伴侶基因同時表達。
表1 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒及其表達的分子伴侶
以pBAD-LRCP為模版,用引物P1、P2進行PCR擴增,電泳后回收含PLRV-CP基因的條帶并與pMD18-T載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α,經(jīng)酶切鑒定與測序篩選出目的克隆,其重組質(zhì)粒命名為pMD18-LRCP。
pColdⅠDNA經(jīng)NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后回收大小約為4 000 bp的大片段,pMD18-LRCP質(zhì)粒經(jīng)同樣的雙酶切后回收500 bp的小片段,兩個片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞,通過酶切鑒定與測序確認表達載體的正確性,并命名為pCold-LRCP。
將重組菌BL21(pCold-LRCP)接種于液體LB培養(yǎng)基(Amp 濃度 100 μg·mL-1)中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,按1∶100將過夜培養(yǎng)物接種于新鮮的LB培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)約3 h,OD600的值達到0.4~0.5,吸出1 mL菌液作為未誘導的對照,剩余菌液中加入IPTG至終濃度為0.1 mmol·L-1,15 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,誘導目的蛋白的表達。
PLRV-CP基因亞克隆及原核表達載體構(gòu)建中,測序分別采用針對pMD18-T與pColdⅠ的載體引物進行,由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
菌體蛋白的提取采用溶菌酶法,取40 μL提取的上清蛋白加入10 μL 5×上樣緩沖液混勻;未經(jīng)誘導的菌體及提取的包涵體用1×蛋白上樣緩沖液懸??;上述樣品煮沸離心后,各取20 μL上清點樣,用12%的SDS-PAGE分析水溶性表達效果。
限制性酶切結(jié)果顯示,質(zhì)粒pG-KJE8中無NdeⅠ的切點(圖1,泳道1~3),pBAD-LRCP中有預期NdeⅠ的單切點(圖1,泳道6~7),pGKJE8轉(zhuǎn)化TOP10(pBAD-LRCP)獲得的單菌落中既有質(zhì)粒pBAD-LRCP,也有pG-KJE8(圖1,泳道4~5),是符合要求的轉(zhuǎn)化子,命名為LR-1。用另外4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化,均獲得了抗Amp與Cm的轉(zhuǎn)化子(LR-2~LR-5)。
圖1 轉(zhuǎn)化子LR-1的酶切鑒定
前期的研究表明,表達載體pBAD-LRCP中,PLRV-CP基因5′端有鐵氧還蛋白基因的片段,采用了融合表達的策略,但表達出的水溶性重組蛋白極少。本試驗用轉(zhuǎn)化子LR-1提取總蛋白,SDSPAGE分析顯示,上清中有一條34 kD的特異性水溶性蛋白質(zhì)條帶(圖2,泳道2),但重組蛋白主要以包涵體形式存在(圖2,泳道3)。轉(zhuǎn)化子LR-2誘導出的水溶性目的蛋白條帶很明顯(圖3,泳道3),其水溶性的表達水平與LR-1相當,另外3種轉(zhuǎn)化子中水溶性重組蛋白的表達量低于LR-1與LR-2。表明分子伴侶的存在使水相中的PLRV重組CP蛋白的量有明顯提高,但沒有期望的多。
圖2 轉(zhuǎn)化子LR-1中PLRV-CP基因的表達
圖3 轉(zhuǎn)化子LR-2中PLRV-CP基因的表達
對PLRV-CP基因進行了T-A亞克隆,測序結(jié)果表明5′與3′分別含NdeⅠ切點、Hind Ⅲ切點的PLRV-CP基因序列已插入T載體中,該重組質(zhì)粒命名為pMD18-LRCP。
pMD18-LRCP與pColdⅠ經(jīng)NdeⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后,回收相應的片段連接,酶切結(jié)果表明,PLRV-CP基因序列已插入表達載體中(圖4),測序結(jié)果顯示PLRV-CP基因的冷激誘導原核表達載體構(gòu)建正確,命名為pCold-LRCP。圖5是該表達載體pCold-LRCP的圖譜,PLRV-CP基因長度為498 bp,處于cspA基因啟動子下游,其表達產(chǎn)物的分子量約為20 kD。
重組菌BL21(pCold-LRCP)經(jīng)低溫誘導,SDS-PAGE檢測表明在20 kD處有一條明顯的特異性蛋白條帶(圖6,泳道2~4),其分子量符合預期,水溶性蛋白中該條帶清晰(圖6,泳道2~3)。表明冷激蛋白啟動子可以增強PLRV-CP基因的水溶原核表達量,且效果好于分子伴侶。
圖4 重組質(zhì)粒pCold-LRCP的酶切圖譜
圖5 pCold-LRCP質(zhì)粒圖譜
圖6 PLRV-CP基因的冷激誘導表達
本試驗比較了提高PLRV-CP基因水溶性表達效果的兩種途徑。首先,用5種表達分子伴侶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化重組菌TOP10(pBAD-LRCP),均可獲得PLRV-CP基因水溶性表達水平提高的轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子LR-1與LR-2中PLRV重組CP的水溶性表達量較高,另外3種轉(zhuǎn)化子的表達量低。其次,利用pColdⅠ構(gòu)建出了PLRV-CP基因的原核表達載體,在冷激蛋白基因cspA的啟動驅(qū)動下,該基因的水溶性表達水平明顯提高,且水溶性重組CP表達量高于分子伴侶途徑。第二種途徑更適合于PLRV水溶性重組CP及其抗血清的大量制備。
大腸桿菌分子伴侶具有協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊,形成天然構(gòu)象的作用,它可增進原核表達重組蛋白的水溶性(崔碩碩 等,2011;許鵬 等,2012)。本試驗中轉(zhuǎn)化子LR-1表達出的伴侶蛋白是DnaKDnaJ-GrpE和GroES-GroEL兩組分子伴侶蛋白,LR-2表達出的伴侶蛋白是GroES-GroEL,但兩種轉(zhuǎn)化子的水溶性重組蛋白表達量接近。即使在分子伴侶存在的情況下,PLRV重組CP仍然以包涵體形式為主,水溶性表達量較低。亓振國等(2011)研究發(fā)現(xiàn)原核表達中,GroES與GroEL具有抑制玉米西羅葉綠三酸:鐵螯合酶在菌體內(nèi)聚集的作用,但DnaK及DnaJ沒有這種作用。針對一個具體的基因,分子伴侶對其水溶性原核表達的作用很難預測,需要通過試驗確認。
冷激蛋白啟動子可實現(xiàn)低溫條件下目的基因的原核表達,也具有增強重組蛋白水溶性表達量的作用(屠小菊 等,2010;杜慶輝 等,2012)。本試驗表明在冷激誘導啟動子驅(qū)動下,水溶性PLRV重組CP的帶型清晰,在總蛋白中占的比例也明顯高于分子伴侶途徑。擴大菌液培養(yǎng)與誘導體系,并將提取的上清蛋白液濃縮后,可通過鎳離子親和層析純化出足量PLRV水溶性CP,滿足制備PLRV抗血清之需。同時有必要進一步優(yōu)化表達體系,提高其表達量,從而提高純化效率與純化量。
Raikhy等(2007)利用水溶性重組CP蛋白制備出了香石竹蝕環(huán)病毒(CERV)抗血清,表明純化抗體(IgG)及其酶標抗體可用于CERV的DASELISA檢測,效果達到了商品試劑盒的檢測水平。馬鈴薯重組CP抗血清的報道中,均采用了純化后的變性蛋白作抗原,未見利用水溶性重組蛋白作抗原的研究;用水溶性重組CP作抗原具有制備出高質(zhì)量馬鈴薯病毒抗血清的潛力,是一個值得深入研究的新領(lǐng)域。
崔碩碩,張鐿,林學政,沈繼紅.2011.分子伴侶共表達對低溫脂肪酶Lip-837異源可溶性表達的影響.海洋科學進展,29(1):105-111.
杜慶輝,賀麗,劉雙喜,張莉君,冒艷麗,朱小平,焦紅梅,李國才.2012.E. coliM15堿性磷酸酶的表達、純化及活性分析.生物技術(shù),22(6):35-38.
李楠楠,左玉玲,隋炯明,蓋樹鵬,樊連梅,李廣存,郭寶太.2011.重組CP多克隆抗體在馬鈴薯卷葉病毒DAS–ELISA檢測中的應用.華北農(nóng)學報,26(6):85-88.
亓振國,張寬亮,陳宗梅,程備久,范軍.2011.大腸桿菌分子伴侶表達的輔助載體構(gòu)建及應用.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報,19(1):171-177.
隋炯明,何心鳳,郭真,李廣存,王晶珊,郭寶太.2012.馬鈴薯卷葉病毒缺失突變CP基因的原核表達及抗血清的制備.園藝學報,39(10):1949-1957.
屠小菊,汪啟明,李秀山,鄧克勤,唐東英,羅澤宇,趙小英,劉選明.2010.擬南芥 DBB1a(double B-box 1a)蛋白的表達、純化及Western blotting檢測.激光生物學報,19(2):224-228.
許鵬,王蕾蕾,程備久,范軍.2012.表達大腸桿菌分子伴侶GroEL、GroES和GrpE載體的構(gòu)建及其應用.激光生物學報,21(1):46-51.
Lopez L,Muller R,Balmori E,de la Riva G,Ramirez N,Doreste V,Lopez M,Perez S,Oramas P,Selman-Housein G.1994. Molecular cloning and nucleotide sequence of the coat protein gene of a Cuban isolate of potato leafroll virus and its expression inEscherichia coli.Virus Genes,9(1):77-83.
Pichova H,Moravec T,Dedic P,Cerovska N.2011.Expression of recombinant potato leafroll virus structural and non-structural proteins for antibody production.Journal of Phytopathology,159(2): 130–132.
Raikhy G,Hallan V,Kulshrestha S,Zaidi A A.2007.Polyclonal antibodies to the coat protein of carnation etched ring virus expressed in bacterial system:production and use in immunodiagnosis.Journal of Phytopathology,155(10):616-622.