青海省6種白粉菌的形態(tài)記述及rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育分析

樊桂芳

（青海湟中縣上新莊鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展服務(wù)中心，811600）

青海省6種白粉菌的形態(tài)記述及rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育分析

樊桂芳

（青海湟中縣上新莊鎮(zhèn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展服務(wù)中心，811600）

對采自青海省的6種白粉菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分類鑒定，并對這幾種rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，分析了這幾種白粉病菌的種類和彼此之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。研究證明，形態(tài)分類學(xué)結(jié)果與分子系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果一致，也證實(shí)國際白粉菌分類理論與方法的合理性。

白粉菌；形態(tài)；系統(tǒng)發(fā)育；青海省

白粉菌是一類廣泛分布世界各地的植物病原真菌，隸屬子囊菌門Ascomycota、錘舌菌綱Leotiomycetes白粉菌科Erysiphaceae，是子囊菌中很獨(dú)特的一類，其極易流行，嚴(yán)重影響植株的生物學(xué)產(chǎn)量及質(zhì)量[1~3]。青海具有特殊的地理位置，地處青藏高原東北部，地形多為盆地、高山和河谷相間分布的高原，海拔較高、降雨量少、晝夜溫差大、日照時(shí)間長、氣候冷涼[4]，有關(guān)青海省的白粉菌研究報(bào)道很少，因此，對青海白粉菌進(jìn)行研究，不僅為該林區(qū)菌物及物種多樣性研究提供基礎(chǔ)資料，也為開展白粉菌生態(tài)學(xué)研究及白粉病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2014年8~9月，在西寧市、樂都、和諾木洪農(nóng)場分別采集了白粉菌標(biāo)本，將標(biāo)本完全壓干后分裝于標(biāo)本袋中保存。

1.2 試驗(yàn)方法

從標(biāo)本刮取其分生孢子、閉囊果進(jìn)行光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS-CX31RTSF）觀察、形態(tài)描述和大小測定。

①分子系統(tǒng)發(fā)育DNA抽提。a.將菌絲體刮下置于1.5 mL離心管，充分研磨。

b.加600 μL CTAB提取液混勻，于60~65℃水浴中溫育1~2 h。

c.加入等體積（600 μL）的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)振蕩器離心管混勻，12 000 r/min下離心10 min。

d.取上清液置于新離心管中，加等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）振蕩器混勻，12 000 r/min下離心10 min。

e.取上清液，加入2倍體積的CTAB沉淀液、混勻，室溫孵育20~30 min，室溫12 000 r/min離心15 min。

f.棄上清液，加350 μL NaCl溶液（1.2 mol/L，DNA溶解液）溶解沉淀，然后加入350 μL氯仿，混勻30 s。

g.離心10 min（12 000 r/min），分層，將上清液移至一新的離心管中，加入0.6~0.8倍體積的異丙醇，混勻，室溫靜置30 min。

h.室溫離心20 min（12 000 r/min），向沉淀加入500 μL 70%乙醇，混勻。

i.離心5 min（12 000 r/min），小心仔細(xì)倒入上清液，棄之。

j.重復(fù)步驟i，室溫干燥后，將DNA溶于50 μL去離子無菌水中，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

②PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增引物參考White等[5]，送上海生物工程有限公司合成。rDNA-ITS PCR引物序列ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

PCR擴(kuò)增體系見表1。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，54~60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸8 min；4℃保存。

③測序分析將PCR產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性對比，找出最相似的序列。利用軟件Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并分析序列結(jié)構(gòu)及序列間親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種白粉菌形態(tài)記述

①穆氏節(jié)絲殼Arthrocladiella mougeotii(Lév.) Vassilkov,Bot.Mater.Otd.Sporov.Rast.Bot.Inst. Komarova Akad.Nauk S.S.S.R.:112,1963.

菌絲體多生于葉面，形成白色較厚的斑片，存留；分生孢子串生，桶柱形、橢圓卵形，（18~29）μm×（10~13）μm，子囊果散生，黑褐色，扁球形，直徑123~155 μm；壁細(xì)胞不規(guī)則多角形，附屬絲58~129根，生于赤道或子囊果上部，常相互交錯纏結(jié)在一起，頂端2~3次雙分叉或少數(shù)三分叉，個(gè)別附屬絲在頂端膨大，上下等粗或基部稍粗，無色、光滑；子囊15~24個(gè)，長橢圓形、卵形，短柄，（50~71）μm×（18~25）μm；子囊孢子2個(gè)，橢圓形，（16~19）μm×（10~12）μm。

表1 PCR擴(kuò)增體系

②鉤狀白粉菌Erysiphe aduncavar.adunca（Wallr.）Fr.Syst.Mycol.3:245,1829.

菌絲體葉面生，形成厚的白色斑片，鋪滿整個(gè)葉片；分生孢子單生，桶柱形或橢圓形，（20~35）μm×（7.5~10.0）μm；閉囊果散生至聚生，暗褐色扁球形，直徑90~172.5 μm，壁細(xì)胞不規(guī)則多角形，直徑5~ 20 μm；附屬絲15~100根，直或彎曲，個(gè)別近曲膝狀，長50.0~182.5 μm，長度為閉囊果直徑的0.5~1.3倍，基部寬5~10 μm，上下近等粗或向上漸粗，壁薄光滑、無色，大多無隔膜僅個(gè)別基部有1隔膜，頂端簡單鉤狀1.0~1.5圈，少數(shù)卷曲2圈，頂端鉤狀部分膨大；子囊6~12個(gè)，卵形、廣卵形、不規(guī)則卵形或近球形，有柄或少數(shù)無柄，（40.0~72.5）μm×（30~55）μm；子囊孢子3~6個(gè)，淡黃色，矩圓形、卵形或長卵形，（17.5~32.5）μm×（10~15）μm。

③豌豆白粉菌Erysiphe pisiDC.,Flore fran-觭aise 2:174,1805.

菌絲體葉兩面生，在葉面形成白色斑片，分生孢子單生，桶柱形或近柱形，（16~32）μm×（9~16）μm；閉囊果散生至近聚生，暗褐色扁球形，直徑73~ 117 μm，壁細(xì)胞不規(guī)則多角形；附屬絲12~16根，大多不分枝，少數(shù)不規(guī)則的分枝1~2次曲折狀至波狀，部分曲膝狀，長41~420 μm，上下近等粗或局部粗細(xì)不均，寬2~6 μm，壁薄，平滑或基部稍粗糙，有0~2個(gè)隔膜，全長褐色、淡褐色或基部褐色而向上近無色；子囊3~10個(gè)，卵形、不規(guī)則卵形或其他不規(guī)則形狀，多數(shù)有短柄少數(shù)近無柄，（39~74）μm×（22~45）μm；子囊孢子4~6個(gè)，卵形、矩圓卵形，淡黃色，（15~33）μm×（10~15）μm。

④蓼白粉菌Erysiphe polygoniDC.,Flore fran-觭aise 2:614,1805.

菌絲體葉兩面生，在葉面形成很厚的白色斑片，存留；分生孢子單生，桶柱形、柱形，（24~55）μm×（10~17）μm；閉囊果近聚生至聚生，暗褐色扁球形，直徑96~122 μm，壁細(xì)胞不規(guī)則多角形；附屬絲9~ 26根，不分枝或不規(guī)則分枝分枝1~2次，彎曲或曲折狀，長26~130 μm，上下近等粗或局部粗細(xì)不均，寬2.0~5.5 μm，壁薄，光滑或略粗糙，有0~2隔膜，基部褐色向上逐漸變淡至無色；子囊4~6個(gè)，不規(guī)則卵形、長卵形，有柄或無柄，（49~65）μm×（28~46）μm；子囊孢子2~4個(gè)，橢圓形或卵矩圓形，黃色，（20~ 30）μm×（10~15）μm。

⑤蒼耳單囊白粉菌Podosphaera xanthii（Castagne）Braun&Shishkoff,in Braun&Takam., Schlecht.4:31,2000.

菌絲體葉兩面生，在葉面居多，形成白色斑片；分生孢子串生，柱形、桶形，（20~33）μm×（10~18）μm；閉囊果散生，暗褐色扁球形，直徑77~113 μm，壁細(xì)胞較大，不規(guī)則多角形；附屬絲4~10根，生于閉囊果的下部，彎曲或曲膝狀，常與菌絲體纏繞，長35~ 525 μm，壁薄，光滑或稍粗糙，上下近等粗或局部粗細(xì)不均，寬4~8 μm，有0~3個(gè)隔膜，全長褐色不分枝；子囊1個(gè)，卵形、近球形，無柄，（52~87）μm×（43~70）μm；子囊孢子6~8個(gè)，橢圓形或卵形，（16~ 25）μm×（10~15）μm。

⑥芍藥白粉菌Erysiphe paeoniaeR.Y.Zheng &G.Q.Chen,Sydowia 34:300,1981.

菌絲體葉兩面生，葉面為主，亦生于葉柄，在最后鋪滿全葉，消失或近存留，分生孢子單生，橢圓形、柱形，（22.5~40.0）μm×（7.5~12.5）μm；閉囊果散生，暗褐色、扁球形，直徑80~110 μm；壁細(xì)胞不規(guī)則多角形，直徑5~20 μm；附屬絲15~32根，彎彎曲曲形狀極不規(guī)則，枯枝狀，大部分不規(guī)則分枝多次，少數(shù)突狀小分枝，長60~155 μm，長度為閉囊果直徑的0.7~1.3倍，粗細(xì)不均，基部寬5.0~7.5 μm；壁薄且粗糙，無隔膜，全長褐色或基部淡褐色向上逐漸變淡至無色；子囊4~6個(gè)，卵形、近球形、或其他不規(guī)則形狀，具短柄或無柄，（47.5~70.0）μm×（30~45）μm；子囊孢子3~6個(gè)，黃色，卵形或橢圓形（17.5~25.0）μm×（10.0~12.5）μm。

2.2 分子系統(tǒng)發(fā)育分析

測序由上海生工進(jìn)行，5種白粉菌的rDNA-ITS區(qū)段測序均測出，長度為394~462 bp，平均429 bp，平均GC含量53.2%。rDNA~ITS序列共544個(gè)位點(diǎn)，其中保守位點(diǎn)267個(gè)、變異位點(diǎn)194個(gè)、簡約信息位點(diǎn)145個(gè)、自裔位點(diǎn)48個(gè)，變異位點(diǎn)和和信息位點(diǎn)分別占全序列的45.2%和33.8%。經(jīng)BLAST同源性比較，驗(yàn)證所測序列是否為目的序列。將所有測出的目的序列和參比序列用ClustalX（version l.8）進(jìn)行序列對準(zhǔn)，刪除缺失位點(diǎn)、殘缺位點(diǎn)、非編碼序列位點(diǎn)并用BioEdit人工調(diào)整后，利用MEGA4.0對rDNA序列進(jìn)行多重比對分析，去除過短序列或混雜序列。

圖1 NJ法構(gòu)建rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

采用鄰近結(jié)合法（neighbor~joining,NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用MEGA 4.0[6]軟件選基于Kimura~2~ Parameter雙參數(shù)模型，并對所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行自舉分析（bootstrap，重復(fù)1 000次），以估算分枝的支持率。rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育NJ樹（圖1）顯示，參試的5種白粉菌與原種的相似度極高，自展值均在97以上，證明為同種，這個(gè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類一致。鉤狀白粉菌Erysiphe aduncavar.、豌豆白粉菌Erysiphe pisiDC.、蓼白粉菌Erysiphe polygoni DC.聚在了一個(gè)大的類群下，為白粉菌屬（Erysiphe），但是這3種白粉菌彼此的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；穆氏節(jié)絲殼Arthrocladiella mougeotii單獨(dú)成一個(gè)分枝，通過屬間關(guān)系比較，發(fā)現(xiàn)其與高氏白粉菌屬的親緣關(guān)系較近，這個(gè)結(jié)果也符合最新的白粉菌分類系統(tǒng)；蒼耳單囊白粉菌Podosphaera xanthii與單囊殼屬的各種一起聚集在了單囊白粉菌屬下。

3 結(jié)論與討論

通過對青海省白粉菌的采集，共發(fā)現(xiàn)白粉菌6種，對這6種白粉菌做了詳細(xì)地描述，并對這6種白粉菌的分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行了研究。結(jié)果證明，形態(tài)學(xué)分類的結(jié)果與分子系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果相一致，也證實(shí)了國際白粉菌分類理論與方法的合理性[7~10]。但這些菌僅是青海省常見的部分種，詳細(xì)的種還需要全面調(diào)查研究。

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The Morphology of Six Powdery Mildew Account and rDNA ITS Phylogenetic Analysis in QingHai Province

FAN Guifang
(Economic Development Service Center in Shang Xinzhuang Town in Huangzhong county in Qinghai)

In this paper,we classified and identified six kinds of powdery mildew in Qinghai on morphological,and carried on rDNA-ITS amplification and sequencing experiments.Phylogenetic tree was constructed.We analyzed the several species phylogenetic relationship between each other.Studies showed that the results of morphological are consistent with subsystem development,and have confirmed the international theories and methods of classifition of powdery mildew are reasonable.

Powdery mildew;Form;System development;Qinghai

S436.421.1+2

A

1001-3547（2015）20-00100-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.038

樊桂芳（1984-），女，本科，助理工程師，從事林業(yè)技術(shù)推廣工作，電話：13997004951，E-mail：770976898@qq.com

2015-08-21