互助縣溫室大棚黃瓜白粉病病原菌分子鑒定及防治技術(shù)

白露佼 ，蔡芳，王鵬

（1.青海省互助縣蔬菜技術(shù)服務(wù)中心，810500；2.西寧市人民公園；3.西寧市林業(yè)站）

青海互助縣位于青藏高原地區(qū)，海拔較高、降雨量少、晝夜溫差大、日照時(shí)間長、氣候冷涼[1]。由于近年來青海省城市化進(jìn)程加快，日光溫室大面積興起，溫室蔬菜的生產(chǎn)發(fā)展非?？?，其中黃瓜因產(chǎn)量較高、采收期短、經(jīng)濟(jì)效益好，被菜農(nóng)廣泛種植。白粉病是黃瓜上常發(fā)生的一種病害，也是一種世界性病害，一般在黃瓜生長后期發(fā)生嚴(yán)重，嚴(yán)重影響黃瓜的生物學(xué)產(chǎn)量及質(zhì)量。目前關(guān)于瓜類白粉菌的分類一直存在爭議，為明確黃瓜白粉菌的分類地位，為互助縣黃瓜白粉病的防治及更深入的研究提供材料，對互助縣溫室大棚黃瓜白粉病病原菌進(jìn)行分子鑒定。

1 材料與方法

1.1 黃瓜白粉菌標(biāo)本的采集

對互助縣種植黃瓜的日光溫室進(jìn)行隨機(jī)調(diào)查，觀察白粉菌在黃瓜植株上寄生的形態(tài)，并對白粉菌進(jìn)行采集。

1.2 黃瓜白粉菌分子鑒定方法

①白粉菌無性型掃描電鏡觀察 根據(jù)Cook等[2]的研究，對黃瓜白粉菌無性型進(jìn)行固定，然后掃描電鏡觀察其分生孢子梗和分生孢子特征，以便進(jìn)行分子鑒定。

a.固定。將被白粉菌侵染的植株組織切成小塊（4 mm×4 mm） 放入盛有戊二醛 （濃度4%，pH值6.8）固定液的小瓶中，貼上標(biāo)簽，注明采集信息。

b.抽氣。將上一步裝樣的小瓶置于真空干燥儀中抽干空氣，至葉片組織完全沉到小瓶底部。

c.制樣 （漂洗、脫水和干燥）。首先用pH值6.8、0.1 moL/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，共進(jìn)行3次，每次 20 min；然后用 30%、50%、70%、90%、100%酒精進(jìn)行梯度脫水，每次20 min，其中100%酒精中脫水2次；最后用100%的乙酸異戊酯置換2次，每次20 min。

將制備好的白粉菌無性型樣品送至西北農(nóng)林科技大學(xué)掃描電鏡觀察室觀察、攝像。

②黃瓜白粉菌基因組DNA提取。a.將菌絲體刮下置于1.5 mL離心管，充分研磨，加600 μL CTAB提取液混勻，于60～65℃水浴中溫育1～2 h。

b.加入等體積（600 μL）的 Tris 飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）振蕩器離心管混勻，離心 10 min（12 000 r/min）。

c.取上清液置于新離心管中，加等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）于振蕩器混勻，然后離心 10 min（12 000 r/min）。

d.取上清液，加入2倍體積的CTAB沉淀液，混勻，室溫孵育 20～30 min，室溫離心 15 min（12 000 r/min）。

f.棄上清液，加 350 μL 1.2 mol/L NaCl溶液（即DNA溶解液）溶解沉淀，然后加入350 μL氯仿，混勻30 s。

g.離心 10 min（12 000 r/min），分層，將上清液移至一新的離心管中，加入0.6～0.8體積的異丙醇，混勻，室溫靜置40 min。

h.室溫離心 20 min（12 000 r/min），向沉淀加入500 μL，70%乙醇，混勻。

i.離心 5 min（12 000 r/min），小心仔細(xì)倒入上清液，棄之。

j.重復(fù)步驟i，室溫干燥后，將DNA溶于40 μL去離子無菌水中，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

③PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增引物參考White等[3]的方法，送上海生物工程有限公司合成。

a.rDNA-ITS PCR引物序列。ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

b.PCR擴(kuò)增體系。見表1。

c.PCR反應(yīng)程序。95℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，54～60℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共 35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸 8 min；4℃保存。

④測序分析 將PCR產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST同源性對比，找出最相似的序列。利用軟件Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并對序列結(jié)構(gòu)及序列間親緣關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 為害癥狀

白粉病主要為害黃瓜的葉片、葉柄及莖，一般不為害果實(shí)，成株及幼苗均可染病。發(fā)病葉片正面或背面產(chǎn)生白色近圓形的小粉斑，即稀疏的菌絲，然后菌絲不斷生長，病部變黃，粉斑逐漸擴(kuò)大成邊緣不明顯的大片白粉區(qū)，布滿葉面，葉面褪綠、枯黃變脆，直至整個(gè)葉片枯死。莖部受害癥狀與葉片相似。粉層嚴(yán)重會(huì)影響光合作用，使植株正常新陳代謝受到干擾，造成早衰，產(chǎn)量受到損失。本次試驗(yàn)觀察采集時(shí)只發(fā)現(xiàn)了白粉菌的無性型即只具有分生孢子，未發(fā)現(xiàn)病菌的有性型即閉囊殼。

2.2 分生孢子形態(tài)鑒定

粉孢屬：菌絲體葉兩面生，在葉面居多，形成白色無定形的斑片；在電鏡下分生孢子串生，柱形、桶形，（18～30）μm×（9～17）μm； 分生孢子梗直，（35～80）μm×（5～10）μm。

2.3 rDNA序列分析

黃瓜白粉菌的rDNA-ITS區(qū)段測序均測出，長度為394～462 bp，平均長度 429 bp，平均 GC含量53.2%。rDNA-ITS序列共544個(gè)位點(diǎn)，其中保守位點(diǎn)267個(gè)、變異位點(diǎn)194個(gè)、簡約信息位點(diǎn)145個(gè)、自裔位點(diǎn)48個(gè)，變異位點(diǎn)和和信息位點(diǎn)分別占全序列的45.2%和33.8%。經(jīng)BLAST同源性比較，驗(yàn)證所測序列是否為目的序列。將所測出的目的序列和參比序列用ClustalX（version l.8）進(jìn)行序列對準(zhǔn)，刪除缺失位點(diǎn)、殘缺位點(diǎn)、非編碼序列位點(diǎn)并用BioEdit人工調(diào)整后，利用MEGA 4.0對rDNA序列進(jìn)行多重比對分析，去除過短序列或混雜序列。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

采用了鄰近結(jié)合法 （neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，利用MEGA 4.0[4]軟件選基于Kimura-2-Parameter雙參數(shù)模型，并對所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行自舉分析（bootstrap，重復(fù)1 000次），以估算分枝的支持率。rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育NJ樹顯示（圖2），本次試驗(yàn)采集的白粉菌與單囊白粉菌屬下的各種一起聚集在單囊白粉菌屬下，與蒼耳單囊白粉菌Podosphaera xanthii的相似度極高，自展值為99，證明為同種。該研究最終證明分子系統(tǒng)發(fā)育與形態(tài)學(xué)鑒定分類結(jié)果相一致，也證實(shí)了國際白粉菌分類理論與方法的合理性[5～8]。

2.4 防治方法

白粉病病菌多以菌絲體、分生孢子在病株殘?bào)w或雜草上越冬，分生孢子萌發(fā)適宜溫度為20～25℃，若濕度大，溫度為16～24℃時(shí)，此病最容易發(fā)生，病菌靠氣流傳播，條件適宜時(shí)，反復(fù)侵染，擴(kuò)大為害。白粉病病菌在30℃以上會(huì)失去活力，可根據(jù)此特點(diǎn)進(jìn)行高溫悶棚滅菌和藥劑防治。在白粉病多發(fā)的棚室，于定植前每100 m2用250 g硫酸加500 g鋸末混勻，點(diǎn)燃熏一夜；也可于白粉病發(fā)生前及初發(fā)期用45%百菌清煙劑熏棚；白粉病發(fā)生后可采用50%硫磺懸浮劑250～300倍液、15%粉銹寧可濕性粉劑1 500倍液、30%特富靈 （氟菌唑）可濕性粉劑1 500～2 000倍液等殺菌劑防治；也可用高錳酸鉀600～800倍液，每隔一周噴施1次，連噴4次；另外也可葉面噴施磷酸鹽和鉀鹽溶液。

圖1 黃瓜白粉菌掃描電鏡照片

圖2 NJ法構(gòu)建rDNA-ITS系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用分子手段明確了寄生于互助縣溫室的黃瓜白粉菌為蒼耳單囊白粉菌Podosphaera xanthii。就目前而言，防治方法仍以化學(xué)防治為主，并結(jié)合高溫悶棚等物理措施。

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