不同西蘭花品種中硫代葡萄糖苷的組分與含量分析

丁云花，何洪巨，宋曙輝，簡元才，趙學(xué)志，王文琪

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，100097）

硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，簡稱硫苷）是西蘭花及其他十字花科蔬菜作物中一類重要的次生代謝物，在內(nèi)源黑芥子酶（Myrosinase）的水解作用下，可產(chǎn)生異硫氰酸鹽和硫氰酸鹽等一系列重要的生物活性物質(zhì)[1]。許多研究表明，這類活性物質(zhì)具有抵抗細(xì)菌、真菌、病毒和蚜蟲等功效[2～6]，同時還具有抗氧化、延緩衰老、防癌抗癌等作用，對人類身體健康具有重要的作用，如由4-甲基硫氧丁基硫苷（Glucoraphanin，RAA）水解產(chǎn)生的蘿卜硫素和由3-甲基吲哚基硫苷（GBC）水解產(chǎn)生的3-吲哚-甲醇被研究證實具有抗癌功效[7～10]。由于西蘭花中含有的萊菔硫烷和異硫代氰酸鹽具有很強(qiáng)的防癌抗癌功能[11～15]，西蘭花的營養(yǎng)保健價值受到越來越多科研人員的關(guān)注。

西蘭花不同品種之間硫苷含量存在明顯的差異，Vallej等[14]研究發(fā)現(xiàn)，生長條件一致的12個西蘭花品種中，最高的硫苷含量為28.3 μmoL/g（干質(zhì)量，下同），最低的僅3.0 μmoL/g。因此，在西蘭花品質(zhì)育種中，硫苷組分與含量是一個值得關(guān)注的重要指標(biāo)。本研究對24個綜合表現(xiàn)優(yōu)良的候選品種和5個市場上流通品種的硫苷組分和含量進(jìn)行了測定與分析，以期為選育高硫苷含量的西蘭花品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的29個西蘭花品種由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。所有品種于2012年春季種植于露地，田間常規(guī)管理，花球長至直徑12～13 cm時采收。品種名稱及來源詳見表1。

1.2 試驗方法

①硫苷的提取 取新鮮西蘭花的花球，分割成小塊，真空冷凍干燥。稱取冷凍干樣0.2 g，放入15 mL塑料管中。加入內(nèi)標(biāo)TRO（苯甲基硫苷）0.25 mL，迅速加入100%預(yù)熱的甲醇，在80℃下水浴20 min，每隔4～5 min渦旋1次。3 000 r/min下離心10 min，取上清液倒入15 mL塑料管中，放在冰盆中。繼續(xù)用70%的甲醇提取2次沉淀物，同上述處理，合并上清液，即為樣品液。取一次性注射器，加入玻璃棉，塞緊，放在試管上。加入DEAE膠溶液2 mL，用2 mL雙蒸水洗滌，然后加入樣品液2 mL。待樣品液不再滴下時，加入0.02 mol/L的NaAc溶液。待不再有液體滴下，將注射器轉(zhuǎn)移到另一試管上，并加入75 μL硫酸酯酶溶液，封口過夜。將過夜的注射器，用雙蒸水洗滌3次，每次0.5mL。用注射頭擠壓注射器，使液體盡可能轉(zhuǎn)移到試管中。將試管中液體通過0.45 μm的濾膜轉(zhuǎn)移到小玻璃瓶中，冷凍保存，待測。

表1 29個西蘭花品種及來源

②硫苷的分析 HPLC分析條件：Waters C18色譜柱，3.9mm×150 mm，5μm；檢測波長229nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL；流動相流速為1.0 mL/min，梯度洗脫條件見表2。

流動相 A：1 g四甲基氯化銨（TMACl）溶于2.0 L雙蒸水中，混勻，抽濾。

流動相 B：1 g 四甲基氯化銨（TMACl）溶于1.6 L雙蒸水中，加入400 mL色譜純乙腈，混勻，抽濾。

采用苯甲基硫苷作為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)保留時間和峰面積對硫苷組分定量測定。利用內(nèi)標(biāo)和響應(yīng)因子來計算硫苷的含量，以μmoL/g為單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 西蘭花硫代葡萄糖苷的組分與分布

采用HPLC法檢測，以苯甲基硫苷（Glucotropaeolin，TRO）為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)保留時間及特征峰形面積對西蘭花硫苷組分進(jìn)行定性和定量測定。結(jié)果可以檢測到8種硫苷：3-甲基硫氧烯丙基硫苷（Glucoiberin，IBE）、 2-羥基-3-丁烯基硫苷（Progoitrin，PRO）、4-甲基硫氧丁基硫苷（Glucoraphanin，RAA）、3-丁烯基硫苷（Gluconapin，NAP）、4-羥基吲哚基-3-甲基硫苷 （4-Hydroxyglucobrassicin，4OH）、3-甲基吲哚基硫苷（Glucobrassicin，GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4-Methoxyglucobrassicin，4ME）、 1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（Neoglucobrassicin，NEO）。根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的不同，前4種屬于脂肪族硫代葡萄糖苷，后4種屬于吲哚族硫代葡萄糖苷。29個西蘭花品種所含8種硫苷的含量見表3。

表3表明，29個西蘭花品種中8種硫苷的總含量均值為11.27 μmol/g，其中吲哚族硫苷含量與脂肪族硫苷相比，總體略高，各占53.06%和46.94%。在各組分中，RAA含量最高，占總硫苷含量的34.78%；其次是 GBC，占 25.02%；第 3是 NEO，占 23.25%（表4）。說明RAA、GBC和NEO是西蘭花中3種主要的硫苷成分。

表2 脫硫硫苷的HPLC梯度洗脫條件

表3 西蘭花不同品種的硫代葡萄糖苷組成及含量 μmoL/g

表4 西蘭花硫代葡萄糖苷成分與分布

2.2 不同西蘭花品種總硫代葡萄糖苷含量

圖1顯示，29個西蘭花品種的總硫苷含量存在較大差異，最高含量是最低的3倍。其中B20和B15的總硫苷含量較高；其次是B19、B9、B35；最低的是B7。以 2 μmol/g為單位分級，從 4～18 μmol/g區(qū)間，每級的品種數(shù)目分別是 1、3、5、9、7、2、2 個，說明大多數(shù)品種的總硫苷含量都分布在中間值附近，高含量和低含量的品種占少數(shù)。

2.3 不同西蘭花品種脂肪族硫代葡萄糖苷含量

由表3可知，29個西蘭花品種均檢測出IBE、PRO、RAA和NAP 4種脂肪族硫苷。該4種脂肪族硫苷的總含量在不同品種之間存在差異 （圖2），其中含量最高的是B15，達(dá)11.01 μmol/g，其次是 B9，最低的是 B4，僅2.81 μmol/g，約為 B15的1/4。其余 26 個品種的脂肪族硫苷含量為 2.85～7.03 μmol/g。在脂肪族硫苷含量中貢獻(xiàn)最大的硫苷成分是RAA，它占4種脂肪族硫苷總量的74.10%；而IBE、PRO和NAP的含量分別僅占脂肪族硫苷總量的5.29%、15.31%和5.29%。而RAA的含量以B9最高，其次是B1，最低的是B4。

2.4 不同西蘭花品種吲哚族硫代葡萄糖苷含量

4 種 吲 哚 族 硫 苷 4OH、GBC、4ME 和NEO在29個西蘭花品種中均有檢出，總含量在不同品種之間也存在較大差異 （圖3），變異范圍在 2.75～10.91 μmol/g，B35、B20、B42和B19的吲哚族硫苷含量較高，均在9.0 μmol/g以上。在吲哚族硫苷含量中貢獻(xiàn)最大的為GBC和NEO兩種硫苷成分，它們分別占4種吲哚族硫苷總量的47.16%和43.81%；4OH和4ME的含量很少，僅占吲哚族硫苷總量的2.68%和6.35%。GBC含量較高的品種有 B20、B19、B40、B22、B49和 B42，均高于 4.0 μmol/g；NEO含量較高的品種有 B35、B42、B16等，均高于 4.4 μmol/g。

圖1 不同西蘭花品種總硫代葡萄糖苷含量

圖2 不同西蘭花品種總脂肪族硫代葡萄糖苷含量

圖3 不同西蘭花品種總吲哚族硫代葡萄糖苷含量

3 討論與結(jié)論

本研究的29個品種中，B18～B23為市場上流通的品種，總硫苷含量 10.99～17.04 μmol/g；其他品種均為商品性優(yōu)良的候選品種，其中B1～B3來自同一個母本，總硫苷含量 9.34～11.00 μmol/g；B4、B5、B34、B40～B43來自同一個母本，總硫苷含量 6.93～13.50 μmol/g；B6～B9來自同一個母本，總硫苷含量5.60～14.19 μmol/g；B10～B14來自同一個母本，總硫苷含量7.22～12.50 μmol/g；B15～B17、B35、B44、B49來自同一個母本，總硫苷含量 10.90～16.96 μmol/g。由此可見，不同親本來源的品種總硫苷含量都存在較大的變異范圍，但 B15～B17、B35、B44、B49這 組 品 種 的 總 硫 苷 含 量 與B18～B23這組市場上流通的商品種基本接近，都處于比較高的水平。前人研究證明，不同品種間由于基因型不同硫苷種類與含量存在差異[16]，本研究也說明不同基因型的品種硫苷含量存在差異，而B15這組品種的親本在西蘭花富硫苷的品質(zhì)育種上或許更有利用價值。

硫苷在同一植物不同器官中含量也存在明顯差異，快速生長的幼嫩部位硫苷含量要高于成熟或衰老組織，如種子和幼芽中的硫苷總量為70～100 mmol/g（鮮質(zhì)量），而同一品種在營養(yǎng)生長后期，總硫苷含量一般只有1～4 mmol/g（鮮質(zhì)量）[17,18]。本研究從蔬菜育種角度考慮，西蘭花的商品器官是成熟的花球，因此考量的是西蘭花商品球的硫苷成分與含量，至于花球中硫苷含量高的品種，其種子和幼芽及其他組織器官的硫苷含量是否也高還有待進(jìn)一步的研究。

[1]Oginsky E L,Stein A E,Greer M A.Myrosinase activity in bacteria as demonstrated by the conversion of progoitrin to goitrin[J].Exp Biol Med,1965，119(2):360-364.

[2]Kliebenstein D,Pedersen D,Barker B,et al.Comparative analysis of quantitative trait loci controlling glucosinolates,myrisubase and insect resistance inArabidopsis thaliana[J].Genetics,2002,161(1):325-332.

[3]Kliebenstein D,Pedersen D,Barker B,et al.Chemical defenses of crucifers:elicitation and metabolism of phytoalexins and indole-3-acetonitrile in brown mustard and turnip[J].Phytochemistry,2002，59(16):611-625.

[4]Hashem F A,Saleh M M.Antimicrobial components of some cruciferae plants (Diplotaxis harraForsk.andErucariamicrocarpaBoiss.)[J]. Phytotherapy Research,1999，13(4):329-332.

[5]Lin C M,Kim J,Du W X,et al.Bactericidal activity of isothiocyanate against pathogens on fresh produce[J].Journal of Food Protection,2000,63:25-30.

[6]Siemens D H,Mitchell-Olds T.Glucosinolates and herbivory by specialists (Coleoptera:Chrysomelidae,Lepidoptera:Plutellidae):consequences of concentration and induced resistance[J].Environ.Entomol,1996，25(16):1 344-1 353.

[7]Tawfiq N,Heaney R K,Plumb J,et al.Dietary glucosinolates as blocking agents against carecinogenesis:glucosinolate breakdown products assessed by induction of quinine reductase activity in murine Hepa-1c1c7 cells[J].Carcinogenesis，1995，16(5):1 191-1 194.

[8]Zhang Y,Kensler T W,Chao C G,et al.Anticarcinogenic activities of sulforaphane and structurally related synthetic norbornyl isothiocyanates[J].Proc Natl Acad Sci USA.，1994，91:3 147-3 150.

[9]Bradfield C A,Bjeldanes L F.Effect of dietary indole-3-carbinol on intestinal and hepatic monooxygenase,glutathione S-transferase and epoxide hydrolase activities in the rat[J].Food Chem Toxicol,1984,22(12):977-982.

[10]Guo Z,Smith T,Wang E,et al.Effects of phenethyl isothiocya-nate,a carcinogenesis inhibitor,on xenobiotic-metabolizing enzymes and nitrosamine metabolism in rats[J].Carcinogenesis,1992,13(12):2 205-2 210.

[11]季宇彬，池文杰，鄒翔，等.西蘭花中異硫氰酸鹽誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG-2凋亡作用及其機(jī)制的研究[J].中國中藥雜志，2007，32（7）：612-615.

[12]鄒翔，郎朗，武曉丹，等.西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽誘導(dǎo)人胃腺癌SGC—7901細(xì)胞凋亡的初步研究[J].中草藥，2007，38（2）：228-231.

[13]鄒翔，季宇彬，武曉丹，等.西蘭花中葡萄糖異硫氰酸鹽對S180小鼠抗氧化功能的影響[J].中國天然藥物，2007，5（2）：134-136.

[14]Zhang Y,T alalay P,Cho C G,et al.A major inducer of anticarcinogenic protective enzymes from broccoli:isolation and elucidation of structure[J].Proc Natl Acad Sci,1994,89(16):2 399-2 403.

[15]Fahey J W,Talalay P.Antioxidant functions of sulforaphane a potent inducer of phase II detoxication enzymes[J].Food and Chemical Toxicology,1999,37:973-979.

[16]Vallejo F,Barberan F A T,Viguera C G.Potential bioactive compounds in health promotion from broccoli cultivars grown in Spain[J].Journal of the Science of Food and A-griculture,2002,82(11):1 293-1 297.

[17]Famham M W,Stephenson K K,Fahey J W.Capacity of broccoli to induce a mamammalian chemoprotective enzyme varies among inbred lines[J].Journal of the Americian Society for Horticultural Science，2000,125(4)： 482-488.

[18]Fahey J W，Zhang Y,Talalay P.Broccoli sprouts:an exceptionally rich source of inducers of enzymes that protect against chemical carcinogens[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1997,94(19):10 367-10 372.