一種新的西瓜果斑病種子帶菌檢測(cè)方法

馬藝蕎，惠長(zhǎng)敏，王秀峰，王利波，陳瑩，王永卓，王健鸝

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，長(zhǎng)春，130033）

一種新的西瓜果斑病種子帶菌檢測(cè)方法

馬藝蕎，惠長(zhǎng)敏，王秀峰，王利波，陳瑩，王永卓，王健鸝

（吉林省蔬菜花卉科學(xué)研究院，長(zhǎng)春，130033）

通過(guò)采用病原菌分離、培養(yǎng)基富集培養(yǎng)與PCR技術(shù)建立了一套西瓜果斑病菌檢測(cè)方法。結(jié)果表明，MOPS緩沖液對(duì)西瓜種子所帶病菌分離效果最佳，且利用WFB1/WFB2引物對(duì)富集到的病菌進(jìn)行PCR檢測(cè)，都產(chǎn)生了預(yù)期360 bp片段；對(duì)BFB純菌液和模擬帶菌種子浸提液的最低檢測(cè)限為1.0×102cfu/mL。利用OD值法結(jié)合平板涂布記菌落數(shù)方法繪制西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=3.984 1x+0.088 1，R2=0.9991（Y×108cfu/mL）。該檢測(cè)方法的建立，為西瓜生產(chǎn)中果斑病防治提供了重要技術(shù)支持。

西瓜；細(xì)菌性果斑病；種子；檢測(cè)

瓜類細(xì)菌性果斑病(Bacterial Fruit Broth，BFB)是一種由西瓜嗜酸菌西瓜種（Acidovorax citrulli）引起的嚴(yán)重的世界性種傳病害[1,2]。經(jīng)KB培養(yǎng)基分離培養(yǎng)的細(xì)菌性果斑病菌的菌落為乳白色、圓形、光滑、金緣、隆起、不透明，菌落直徑1～2 μm，在365 nm紫外線照射下，菌落不發(fā)亮，即不產(chǎn)生熒光色素，對(duì)光觀察菌落周圍有透明圈[3]。瓜類細(xì)菌性果斑病分別被農(nóng)業(yè)部（2006年）和國(guó)家質(zhì)檢總局（2007年）列入我國(guó)規(guī)定的檢疫性病害之一[4]。瓜類細(xì)菌性果斑病主要為害葫蘆科植物，如西瓜、甜瓜、南瓜、黃瓜等，自報(bào)道以來(lái)已經(jīng)在山東、內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、海南等省發(fā)生，給當(dāng)?shù)氐奈鞴戏N植業(yè)造成嚴(yán)重的損失[5，6]。

細(xì)菌性果斑病主要通過(guò)種子遠(yuǎn)距離傳播[7]，病菌在種子中的存活時(shí)間較長(zhǎng)，且抗逆能力強(qiáng)，主要存活在種皮下的胚乳表層[8]，因此在生產(chǎn)中使用健康無(wú)菌的種子是防止細(xì)菌性果斑病發(fā)生和傳播的關(guān)鍵。

當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)細(xì)菌性果斑病的檢測(cè)方法主要采用半選擇性培養(yǎng)基、ELISA、PCR及實(shí)時(shí)熒光定量PCR法等技術(shù)。ELISA法應(yīng)用最普遍，Walcott等[9]利用Elisa法檢測(cè)了西瓜種子帶菌情況，其靈敏度為105cfu/mL，但不能區(qū)分與果斑病菌同屬的其他亞種；熊亮斌等[10]建立改良DAS-Dot-ELISA法檢測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌，檢測(cè)靈敏度為1.9×105cfu/mL；馮建軍等[11]利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌，其靈敏度達(dá)103~104cfu/mL；Ha等[12]將磁珠捕獲法和多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR相結(jié)合，可檢測(cè)到5 000粒種子中存在一粒帶病種子。但由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需儀器耗材成本較高，且成本低的半選擇性培養(yǎng)基法的檢測(cè)靈敏度較低，因此在實(shí)際生產(chǎn)中需要建立一套靈敏、快速且特異性較高的檢測(cè)方法。本研究在已有檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，采用病原菌分離、培養(yǎng)基富集培養(yǎng)與PCR技術(shù)相結(jié)合，建立一套病原菌分離-富集培養(yǎng)-PCR鑒定檢測(cè)體系，以期為生產(chǎn)中檢測(cè)西瓜種子果斑病帶菌情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種：華欣西瓜種子（北京京研益農(nóng)科技發(fā)展中心生產(chǎn)）。供試菌株：西瓜果斑病Pslb27菌株（由中國(guó)農(nóng)科院植保所趙廷昌提供）。供試培養(yǎng)基為KBA培養(yǎng)基（蛋白胨20 g、硫酸鎂1.5 g、磷酸氫二鉀1.5 g、甘油10 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL、pH值7.0）（以上試劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與試劑

PCR儀為東勝創(chuàng)新生物科技有限公司EDC-810，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為上海精科UV759，凝膠成像系統(tǒng)為UVP BioDoc-It（美國(guó)）。PCR反應(yīng)體系中10×PCR buffer、dNTPs、10×Taq buffer、Taq DNA聚合酶購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 細(xì)菌性果斑病病原菌濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在KBA平面培養(yǎng)基上培養(yǎng)Pslb27病原菌菌株，挑取生長(zhǎng)良好的病原菌單菌落在液體KB液體培養(yǎng)基中，28℃下220 r/min搖菌過(guò)夜（16~18 h）至細(xì)菌指數(shù)生長(zhǎng)期，將菌懸液用KB培養(yǎng)基梯度稀釋6、8、10、12、14、16、18倍，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600nm下測(cè)定OD值，取其OD值在0.2~0.8繪制果斑病病原菌濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線。將菌懸液采用涂布記菌落數(shù)的方法用KB液體培養(yǎng)基稀釋進(jìn)行平板計(jì)數(shù)[13]。

1.4 果斑病4個(gè)梯度病原菌的稀釋與接種

挑選在KB平板上生長(zhǎng)良好的單菌落，在KB液體培養(yǎng)基中28℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。用KB液體培養(yǎng)基對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋，在波長(zhǎng)600下nm測(cè)定OD值使其在0.2~0.8，利用之前繪制的果斑病病原菌標(biāo)準(zhǔn)曲線得出此菌懸液的準(zhǔn)確濃度，用KB液體培養(yǎng)基將菌懸液稀釋為1×102、1×104、1×106、1×108cfu/mL 4個(gè)梯度。按照1g種子3mL菌液的比例，將健康種子分別浸泡在不同濃度的菌懸液中[14]，25℃搖床160r/min接菌90min，取出后于超凈工作臺(tái)過(guò)夜晾干，以超純水浸泡種子為對(duì)照，共進(jìn)行5個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)處理20粒種子。

1.5 不同浸提液對(duì)種子病菌的分離、富集培養(yǎng)效果比較

0.04 mol/L MOPS（3-丙磺酸）浸提液[4]配制：800mL蒸餾水中加入40mmol/LMOPS，CaCl22g調(diào)pH值至7.3，加水定容至1 L；0.04 mol/L PBS浸提液配制：NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO41.15 g，蒸餾水800 mL，用HCl調(diào)溶液pH值至7.4，加水定容至1 L。MOPS浸提液、PBS浸提液分別于121℃高壓蒸氣滅菌20 min，室溫保存。

以超純水、MOPS浸提液、PBS浸提液作為帶菌種子的病菌浸提液，按照1 g種子3 mL浸提液的比例，將不同濃度菌懸液接種的西瓜種子及超純水對(duì)照（CK）種子分別放入滅菌離心管中，30℃、220 r/min搖培4 h[4]，重復(fù)3次。吸取搖培后的浸提液100 μL涂布于KB固體平板上，28℃培養(yǎng)48 h，比較平板上3次重復(fù)的平均菌落個(gè)數(shù)。

1.6 細(xì)菌性果斑病原菌的PCR鑒定

挑取1×102cfu/mL接種濃度下PBS和MOPS浸提液分離出的KB平板上菌落直徑1～2 μm乳白色、圓形、光滑、隆起、不透明的單菌落，置于5 μL超純水中，PCR儀上99℃裂解15 min后迅速置于冰上，將以此作為模板進(jìn)行PCR。特異性引物WFB1（5'GAC CAG CCA CAC TGG GAC 3'）和WFB2（5'CTG CCG TAC TCC AGC GAT 3'）[9,15]，該引物由上海生工公司合成。

PCR擴(kuò)增體系：10×PCR buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，10×Taq buffer 2 μL，WEB1/WEB2各1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，模板5 μL，超純水補(bǔ)足至20 μL。

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸40 s，30次循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

表1 西瓜細(xì)菌性果斑病OD值與菌液濃度統(tǒng)計(jì)

圖1 不同浸提液對(duì)種子帶菌分離情況涂板比較

2.1 西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

利用OD值法結(jié)合平板涂布記菌落數(shù)方法繪制西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用涂布記菌落數(shù)的方法確定病原菌菌懸液的濃度為2.3×109cfu/mL；取OD值在0.2~0.8的稀釋梯度（8、10、12、14、16倍），算出對(duì)應(yīng)菌液濃度（表1），利用菌液濃度與OD值之間的線性關(guān)系，繪制西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.984 1x+0.088 1（R2= 0.9991）（Y×108cfu/mL）。

2.2 不同浸提液對(duì)種子病菌的分離、富集培養(yǎng)效果比較

平板涂布的富集菌落結(jié)果如圖1所示。對(duì)1×102、和1×104cfu/mL接菌濃度下3種浸提液的KB平板涂布菌落數(shù)計(jì)數(shù)（圖2），結(jié)果表明，在1×102cfu/mL接菌濃度的3次重復(fù)中，超純水涂布平板沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，PBS浸提液涂布平均菌落數(shù)為1個(gè)，MOPS浸提液平均菌落數(shù)為2個(gè)；在1×104cfu/mL接菌濃度的3次重復(fù)中，超純水涂布平均菌落數(shù)為89個(gè)，PBS浸提液涂布平均菌落數(shù)為206個(gè)，MOPS浸提液平均菌落數(shù)為277個(gè)。綜上所述，MOPS和PBS浸提液對(duì)不同接菌濃度的西瓜種子的果斑病菌分離效果均優(yōu)于超純水，且MOPS浸提液的分離效果明顯優(yōu)于PBS浸提液，以超純水為浸提液不能對(duì)1×102cfu/mL接菌濃度下的西瓜種子所帶病菌進(jìn)行準(zhǔn)確分離。

以1×102cfu/mL和1×104cfu/mL接菌濃度為例，比較3種浸提液對(duì)種子帶病原菌分離情況。藍(lán)色為超純水分離菌落個(gè)數(shù)，紅色為PBS緩沖液分離菌落個(gè)數(shù)，綠色為MOPS緩沖液分離菌落個(gè)數(shù)。

2.3 細(xì)菌性果斑病病原菌的PCR鑒定

利用合成的特異性引物，對(duì)在1×102cfu/mL接種濃度下，PBS和MOPS浸提液分離出的果斑病進(jìn)行PCR，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳及成像系統(tǒng)分析。結(jié)果如圖3所示，對(duì)PBS和MOPS浸提液分離出的菌落進(jìn)行PCR，均出現(xiàn)360 bp目標(biāo)條帶，從分子水平進(jìn)一步證實(shí)，PBS和MOPS浸提液分離出的菌落均為西瓜細(xì)菌性果斑病菌。

3 結(jié)論與討論

本研究利用OD值法，結(jié)合涂布記菌落數(shù)方法，繪制西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=3.984 1x+0.088 1，R2=0.999 1（Y×108cfu/mL）。分光光度計(jì)的有效OD范圍一般在0.2~0.8。通過(guò)對(duì)果斑病菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使其OD值在分光光度計(jì)有效讀數(shù)范圍內(nèi)，即可通過(guò)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確計(jì)算出果斑病病原菌濃度，解決了傳統(tǒng)涂布記菌落數(shù)法操作復(fù)雜且周期長(zhǎng)等問(wèn)題，大大提高了效率。

本研究比較了超純水、MOPS緩沖液及PBS緩沖液對(duì)模擬帶菌西瓜種子的病菌分離情況。結(jié)果表明，通過(guò)不同浸提液分離病原菌、涂布KB平板及富集培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)分析初步鑒定了西瓜種子所帶病菌為西瓜細(xì)菌性果斑病。本研究表明，在數(shù)量和質(zhì)量方面MOPS緩沖液都明顯優(yōu)于超純水及PBS緩沖液。這與任毓忠等[16]研究得出的在西瓜種子病菌分離方面PBS緩沖液優(yōu)于水的結(jié)論一致；也與許福壽等[4]研究對(duì)比的MOPS緩沖液在對(duì)西瓜種子病菌的分離效果上優(yōu)于PBS緩沖液的結(jié)論一致。因此MOPS緩沖液在對(duì)西瓜種子病原菌分離方面效果較優(yōu)。本研究中MOPS緩沖液能分離出1×102cfu/mL模擬接種濃度下種子帶有的較少病原菌。

圖2 不同浸提液下種子帶病原菌分離情況

圖3 不同浸提液分離出的BFB單菌落PCR

本研究以Walcott等[9]報(bào)道的果斑病病原菌WEB1/WEB2為引物，對(duì)PBS和MOPS浸提液在1×102cfu/mL模擬帶菌種子分離出的單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果均出現(xiàn)目標(biāo)條帶，從分子水平進(jìn)一步表明PBS和MOPS浸提液分離出的菌落均為西瓜細(xì)菌性果斑病菌。結(jié)果證明，此方法最低可檢測(cè)出1×102cfu/mL左右菌體，較熊亮斌等[10]建立改良DAS-Dot-ELISA法1.9×105cfu/mL檢測(cè)靈敏度提高1 000倍，較馮建軍等[11]建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 103～104cfu/mL檢測(cè)靈敏度提高至少10倍。

綜上所述，本研究建立了一套快速、靈敏、低成本的病原菌分離-富集培養(yǎng)-PCR檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度可達(dá)1×102cfu/mL。應(yīng)用此方法對(duì)西瓜種子進(jìn)行果斑病檢測(cè)，有望為西瓜細(xì)菌性果斑病的防控提供病害預(yù)警，以減少病害損失，對(duì)促進(jìn)西瓜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要價(jià)值。

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A New Pathogen Detection Methodon for Watermelon Seeds

MA Yiqiao,HUI Changmin,WANG Xiufeng,WANG Libo, CHEN Ying,WANG Yongzhuo,WANG Jianli
(Jilin Academy of Vegetable and Flower Science,Changchun,130033)

In this study,we established a separation-enrichment-PCR detection system.The results showed the MOPS solution was the best one for detecting the seeds carrying BFB,the enrichment of bacteria was amplified by the primer sets WFB1/ WFB2 and all produced 360 bp specific fragments;the method assay had a lowest detection limit of 1.0×102 cfu/mL.We drew a watermelon bacterial fruit blotch of standard curve:Y=3.9841x+0.0881,R2=0.9991(Y×108cfu/mL).This method can greatly increase the precision of this detection and provide an important technical support for the prevention and control of BFB.

Watermelon;Baetefial fruit blotch;Seed;Detection

S651；S436.42

A

1001-3547（2015）20-0091-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.20.035

國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-26-26）；吉林省西瓜細(xì)菌性果斑病快速檢測(cè)及綜合防治技術(shù)研究（20130102047JC）

致謝：感謝國(guó)家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲(chóng)害防控研究室趙廷昌教授對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)與幫助！

馬藝蕎（1984-），女，碩士，助理研究員，主要從事植物保護(hù)研究，電話：13944852755，E-mail：xiaoquezai@163.com

惠長(zhǎng)敏，通信作者，女，研究員，E-mail：huichm@126.com

2015-07-23