急性胃黏膜損傷大鼠前爪不同區(qū)域血含量及特定部位黑色素含量變化的研究

秦培潔等

[摘要] 目的 探討生理、病理狀態(tài)下大鼠上肢手掌不同區(qū)域血含量和上肢手掌皮膚黑色素變化，為氣色形態(tài)手診乃至中醫(yī)學(xué)的“司外揣內(nèi)”提供合理的研究方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 隨機(jī)將SD雄性大鼠20只分為正常組和模型組，每組各10只。利用無水乙醇灌胃復(fù)制急性胃損傷模型后，兩組分別從大鼠尾靜脈中給予一定濃度的伊文斯蘭（EB）生理鹽溶液。通過測量手掌不同部位組織內(nèi)EB的吸光度（A）值大小，間接反映手掌各區(qū)域血含量的變化情況。利用多巴氧化酶檢測兩組大鼠前爪皮膚黑色素變化。 結(jié)果 ①模型組大鼠前爪5區(qū)的A值（0.96±0.46）顯著高于正常組（0.35±0.17），差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。②模型組大鼠5區(qū)的黑色素細(xì)胞增多。 結(jié)論 應(yīng)激性胃潰瘍的大鼠的病理變化可以在手掌特定區(qū)域反映出，初步推斷這種變化是通過血流量的變化和手掌皮膚的黑色素變化實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 手診；急性胃黏膜損傷；大鼠前爪；血含量；黑色素含量

[中圖分類號] R241 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）05（c）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the change of blood content and melanin in different area of forepaw skin in rat under physiological and pathological conditions， in order to provide reasonable research methods and experimental basis for hand diagnosis and Qisexingtai of traditional Chinese medicine. Methods Twenty SD rats were randomly divided into two groups， normal group and model group， with 20 rats in each group. Acute gastric mucosal injury model was established by intragastric administration of anhydrou ethanol. Rats tail vesns were injected a certain concentration Evan blue （EB） saline solution. Then， by detecting the photo-absorption rate （A value） of the EB in the tissues of the different zones of forepaws， the changes of blood contents in the different areas was examine indirectly. The melanin of rat forepaw skin was detected by dopa oxidase. Resluts ①The A values in 5 zones of model group （0.96±0.46） was higher than that of normal group （0.35±0.12）， the differences was statistically significant （P < 0.05）. ②The melanin in 5 zones were significantly increased. Conclusion The pathological changes of stress ulcer in rats can be reflected on particular area of forepaw in acute gastric mucosa injury rats， preliminary conclusion the change is realized through the blood flow change and the palmar skin melanin change.

[Key words] Hand diagnosis； Acute gastric mucosa injury； Rat forepaw； Blood content； Melanin content

氣色形態(tài)手診是在中醫(yī)望色診病理論基礎(chǔ)上建立起來的，對受傷特定部位的氣、色、形態(tài)變化進(jìn)行有目的的觀察，并對收集到的信息進(jìn)行分析，以了解人體健康狀況的一種診斷方法[1-3]。本研究探討生理、病理狀態(tài)下大鼠上肢手掌不同區(qū)域血含量和上肢手掌皮膚黑色素變化，為氣色形態(tài)手診乃至中醫(yī)學(xué)的“司外揣內(nèi)”提供合理的研究方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

SD雄性大鼠（8周齡）20只，平均體重（250±10）g（中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，批號：0019071）。伊文斯蘭（Evans blue，EB）（FLU KA進(jìn)口分裝），75%乙醇（上海利康消毒高科技有限公司），多巴胺氧化酶（DopA）（Cayman），磷酸氫二鈉（biotopped），磷酸氫二鉀（福晨化學(xué)），甲醛溶液（sigma），硫酸鋁（sigma）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

將20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為兩組，正常組和急性胃黏膜損傷模型組（模型組），每組各10只。

1.2.2 模型建立

模型組大鼠按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后用75%乙醇，按照1 mL/100 g比例進(jìn)行灌胃，進(jìn)而誘導(dǎo)成急性胃黏膜損傷模型；正常組大鼠則按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察

肉眼觀察兩組大鼠的胃大體標(biāo)本和前爪特定部位的皮膚標(biāo)本。

1.3.2 胃潰瘍指數(shù)

用4%甲醛溶液固定各組大鼠的胃組織，沿胃大彎剪開，顯微鏡下觀察出血性病灶，采用測微尺計(jì)算胃黏膜損傷面積。計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：正常胃黏膜；1分：點(diǎn)狀損傷；2分：病損<1 mm；3分：1 mm≤病損<2 mm；4分：2 mm≤病損<3 mm；依次類推，胃潰瘍指數(shù)=全胃評分的總和[1]。

1.3.3 組織病理學(xué)檢查

取大鼠胃竇部組織，石蠟切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃壁 4 層結(jié)構(gòu)是否清晰，胃黏膜表面是否光滑，上皮是否完整，腺體排列是否整齊。

1.3.4 大鼠前爪特定部位血含量變化測定方法

1.3.4.1 EB標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)參考文獻(xiàn)[2]結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的要求進(jìn)行改良，丙酮和生理鹽溶液按照7∶3混合后中加入EB，配制成溶度為25、125、625、3.12、1.56、0.78、0.39 μg/mL的溶液。用722型分光光度計(jì)在600 nm測量吸光度（A）值，測量方法：在600 nm處用722型分光光度計(jì)測得，其中濃度為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)。從圖1可見EB溶度與A值之間存在較好的線性關(guān)系，其回歸直線方程：Y = 0.028X+0.027，r = 0.9990，為EB標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2 實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食不禁水24 h，術(shù)前2 h禁水。模型組大鼠按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后用75%乙醇，按照1 mL/100 g比例進(jìn)行灌胃，進(jìn)而誘導(dǎo)成急性胃黏膜損傷模型；空白組大鼠則按照2 mL/kg比例腹腔注射0.9% NaCl溶液，1 h后按照1 ml/100 g比例用0.9% NaCl溶液灌胃。2 h后麻醉取胃，脫頸椎處死大鼠后迅速從前肢肘后剪下前爪，放2℃冰箱冰箱冷藏10 min后取出固定在塑料泡沫上，放入液氮中，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱冷凍。依據(jù)大鼠前爪蹼的分布特點(diǎn)，參考?xì)馍螒B(tài)手診特點(diǎn)[3]，由圖2可見沿蹼邊界將大鼠前爪分為9個(gè)區(qū)域[4]，每區(qū)分別取區(qū)域內(nèi)肌健以上組織，放7∶3丙酮生理鹽溶液中浸泡72 h，以1500 r/min離心10 min，用722型分光光度計(jì)在600 nm處測量上清液的A值[5]。

1.3.5 大鼠前爪特定部位黑色素變化測定[6-8]

1.3.5.1 試劑配制 0.0056 mol/L DopA液的配制：稱取DopA 1.10 g，溶解于1000 mL蒸餾水。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制：A液，0.1 mol/L磷酸氫二鈉35.8 g溶解于1000 mL蒸餾水；B液，磷酸二氫鉀13.6 g溶解于1000 mL蒸餾水；取A液9份與B液1份混合，pH調(diào)至7.4。孵育液配制法：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4），溶入0.0056 mol/L的DopA內(nèi)。將配制好的孵育液保存于冰箱內(nèi)備用。

1.3.5.2 操作步驟 取大鼠5區(qū)皮膚作為標(biāo)本，用10%甲醛固定組織1 h（22℃）或4～8 h（4℃），修切已固定的組織塊，厚3～5 mm，流水沖洗3 min，組織塊浸于孵育液中1 h（37℃）流水沖洗2～6 h，在Bouin液中重新固定24 h。各級乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度8 μm，用5%硫酸鋁水溶液配制的0.1%核固紅，復(fù)染10 min，流水沖洗片刻至核深紅色，胞質(zhì)帶紅色為止。最后脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃潰瘍形態(tài)學(xué)觀察

正常組和模型組大鼠胃大體的形態(tài)學(xué)觀察特點(diǎn)總結(jié)見表1，具體形態(tài)見圖3～4（封三）。

2.2 胃潰瘍指數(shù)

與正常組比較，模型組的胃潰瘍指數(shù)（78.39±15.98）顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示造模成功。

2.3 組織病理學(xué)觀察

空白組大鼠的胃沒有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，具有較為完整的胃黏膜，黏膜、黏膜下層、肌層及漿膜層結(jié)構(gòu)完整，胃小凹結(jié)構(gòu)和黏膜腺體排列整齊。見圖5（封三）模型組大鼠的胃黏膜結(jié)構(gòu)排列紊亂，黏膜上皮層在部分區(qū)域缺失，甚至累及胃黏膜固有腺體，并伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，潰瘍床有肉芽組織形成。見圖6（封三）。

2.4 大鼠前爪特定部位血含量變化

正常組大鼠前爪各區(qū)的A值普遍較低。模型組大鼠前爪除5區(qū)外，其他均未明顯升高（P > 0.05）；而模型組大鼠前爪5區(qū)的A值則明顯升高，顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.5 大鼠前爪特定部位黑色素變化

由圖7～8（封三）可見，與正常組比較，模型組的黑色素細(xì)胞增多。

3 討論

氣色形態(tài)手診時(shí)在中醫(yī)望色診病理論基礎(chǔ)上建立起來的，在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下結(jié)合臨床實(shí)踐由劉劍鋒教授首次提出的創(chuàng)新中醫(yī)診斷方法。20多年來已在臨床實(shí)踐中得到了大量的驗(yàn)證和推廣[9-12]。在大量臨床實(shí)證的基礎(chǔ)上，近年來課題組致力于尋找氣色形態(tài)手診的機(jī)制以期為中醫(yī)“司外揣內(nèi)”理論提供研究方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在氣色形態(tài)氣色形態(tài)手診理論中，胃區(qū)位于手掌的正中心，呈正圓形，向左不超過生命線，向右不超過無名指豎直平分線，而在病理狀態(tài)下，該區(qū)的氣色形態(tài)將發(fā)生一定的改變[3]。

通過本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，臨床和實(shí)驗(yàn)中多用EB作為血清蛋白的標(biāo)志物測定血漿容量[11]，對于應(yīng)激性胃潰瘍這種急性損傷而言，一方面考慮是該區(qū)域血含量發(fā)生變化而導(dǎo)致視覺上的變化，另一方面考慮是否導(dǎo)致該區(qū)域黑色素細(xì)胞增加進(jìn)而會(huì)有視覺上的改變。基于此假設(shè)，本課題組開展了研究，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠前爪的5區(qū)A值也就是胃區(qū)的A值顯著高于正常組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。說明假設(shè)成立，應(yīng)激性胃潰瘍可導(dǎo)致大鼠前爪胃區(qū)的血流含量發(fā)生變化進(jìn)而引起視覺的改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了本課題組前期的工作。本研究采用多巴氧化酶法[13-14]檢測各組大鼠前爪皮膚黑色素情況，通過圖7～8（封三）可以看出模型組大鼠的5區(qū)黑色素細(xì)胞明顯增多，為假設(shè)提供了初步佐證，至于其機(jī)制如何，有待課題組的進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2014-11-01 本文編輯：蘇 暢）