紅提葡萄霜霉病拮抗菌SZ9、LT3抑菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性研究

王芬　韓鵬

摘 要：為研究紅提葡萄霜霉病拮抗菌SZ9、LT3無菌發(fā)酵濾液的穩(wěn)定性，以紅提葡萄霜霉病病原菌為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定無菌發(fā)酵濾液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性以及光穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，兩株菌的抑菌活性物質(zhì)在pH 值5～9、-10～50 ℃時(shí)均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌活性，具有較好的耐儲(chǔ)性，紫外燈照射10 h后仍具有較高的活性。研究認(rèn)為拮抗菌SZ9、LT3無菌發(fā)酵濾液具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、耐儲(chǔ)藏和光穩(wěn)定性，具有一定的開發(fā)和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：紅提葡萄霜霉病；拮抗菌；生物防治；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：S436.631 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.027

紅提葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌[Plasmopara viticola（Berk.et Curtis） Berl.etde Toni]引起的真菌病害[1]。該病害遍及全國(guó)各大紅提葡萄種植產(chǎn)區(qū)，是紅提葡萄生產(chǎn)的一大病害，尤其是春、夏多雨年份更為嚴(yán)重。霜霉病主要危害紅提葡萄的葉片，同時(shí)還能危害新梢、幼果和花序等部分及成熟果實(shí)，染病的植株長(zhǎng)勢(shì)極弱，果實(shí)質(zhì)量差，影響當(dāng)年紅提葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，增加生產(chǎn)成本，嚴(yán)重的還會(huì)造成植株不能正常越冬，影響樹勢(shì)和來年生產(chǎn)，甚至整株死亡[2-5]。

目前該病的防治主要通過化學(xué)方式防治，但其往往會(huì)帶來農(nóng)藥殘留過高、嚴(yán)重破壞葡萄的生態(tài)環(huán)境等問題[6-7]。生物防治技術(shù)是近年來發(fā)展的一種安全、無污染、無殘留的病害防治方法，不容易產(chǎn)生抗藥性，低殘留，具有對(duì)人畜無毒害、對(duì)生態(tài)環(huán)境影響小等多種優(yōu)點(diǎn)，因此引起越來越多的人對(duì)其進(jìn)行開發(fā)研究，期望其能作為病害防治的重要途徑[8]。

SZ9、LT3菌株是筆者所在實(shí)驗(yàn)室從紅提葡萄大田根際的土壤中篩選出的對(duì)紅提葡萄霜霉病、白粉病、炭疽病均有較強(qiáng)抑菌效果的拮抗菌株，本研究提取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液，以霜霉病為指示菌，對(duì)這兩株菌種的拮抗效果的穩(wěn)定性進(jìn)行初步探討，以期對(duì)該病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

病原菌：紅提葡萄霜霉病病原菌Plasmopara viticola從陜西省微生物研究所獲得，病原菌接種于PDA斜面上，冰箱3 ℃保存。

拮抗菌：前期試驗(yàn)篩選取得，實(shí)驗(yàn)室NA斜面培養(yǎng)基保存。

培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，加入1.5%～2%的瓊脂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液的制備 用接種針挑取NA固體斜面上保存的SZ9、LT3菌種，在NA固體平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取單菌落于NA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，225 r·min-1搖床培養(yǎng)36 h。將發(fā)酵液8 000 r·min-1離心15 min，取其上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，得發(fā)酵濾液。

1.2.2 拮抗菌株無菌發(fā)酵濾液拮抗穩(wěn)定性測(cè)定

（1）拮抗菌株發(fā)酵濾液抑菌圈測(cè)定。以紅提葡萄霜霉病病原菌為指示菌，利用牛津杯法測(cè)定發(fā)酵濾液的抑菌活性[9]。首先將病原菌液涂布于NA固體平板上，把滅過菌的牛津杯放置于平板中央，吸取1 mL的拮抗菌發(fā)酵濾液于牛津杯中，把平板放置在超凈臺(tái)中，直至液體完全滲透，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。30 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果并測(cè)定抑菌圈大小[10]。

（2）熱穩(wěn)定性測(cè)定。分別取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個(gè)三角瓶20 mL，分別在-10，0，30，50，70，90，121 ℃中處理15 min，牛津杯法測(cè)定各處理發(fā)酵液對(duì)紅提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（3）酸堿穩(wěn)定性測(cè)定。分別取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個(gè)三角瓶20 mL，用1 mol·L-1 HCl和NaOH將發(fā)酵濾液的pH值調(diào)至3～11，靜置2 h，牛津杯法測(cè)定各處理發(fā)酵濾液對(duì)紅提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（4）儲(chǔ)存時(shí)間穩(wěn)定性測(cè)定。 取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個(gè)三角瓶20 mL，分別放置在冰箱（4 ℃）中，以未放置處理的發(fā)酵濾液為對(duì)照，每2個(gè)月進(jìn)行1次試驗(yàn)，牛津杯法測(cè)定各處理對(duì)紅提葡萄霜霉病病原菌的抑菌效果。

（5）紫外線照射穩(wěn)定性測(cè)定。取SZ9、LT3菌株的發(fā)酵濾液于三角瓶中，每個(gè)三角瓶20 mL，置于25 W的紫外線燈下，距燈5 cm處分別照射2，4，6，8，10 h，以未經(jīng)紫外線照射處理的發(fā)酵濾液作對(duì)照，牛津杯法測(cè)定各處理對(duì)紅提葡萄霜霉病的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌無菌發(fā)酵液熱穩(wěn)定性

如圖1所示，隨著處理溫度的變化，兩株拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力均有變化，在-10，0，30，50 ℃ 4種溫度處理下，兩株菌種都保持較高的抑菌活性，其中30 ℃的處理下，抑菌活性最高。SZ9在70 ℃的處理下，活性顯著下降，LT3在70 ℃的處理下活性有所下降，兩株拮抗菌在90 ℃和121 ℃的處理下均基本失活。

2.2 拮抗菌無菌發(fā)酵液對(duì)酸堿的穩(wěn)定性

如圖2所示，隨著pH值的變化，兩株拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力均有所變化，pH值為5～9的范圍內(nèi)，抑菌活性較為穩(wěn)定，當(dāng)pH值小于5.0或者大于9.0時(shí)，抑菌活性下降十分顯著，說明這兩株拮抗菌的活性物質(zhì)對(duì)極端的酸堿條件比較敏感。

2.3 拮抗菌無菌發(fā)酵液儲(chǔ)存時(shí)間的穩(wěn)定性

如圖3所示，隨著放置時(shí)間的增加，拮抗菌SZ9、LT3的抑菌活性物質(zhì)的抑菌能力表現(xiàn)比較穩(wěn)定，說明放置時(shí)間對(duì)無菌發(fā)酵濾液的抑菌效果影響不大。

2.4 拮抗菌無菌發(fā)酵液對(duì)紫外線的穩(wěn)定性

如圖4所示，拮抗菌SZ9、LT3無菌發(fā)酵液在紫外光下照射2～10 h后，其抑菌活性沒有顯著的降低，表明兩株拮抗菌在紫外線的照射下仍能保持較強(qiáng)的抑菌活性。

3 結(jié)論與討論

拮抗菌防治病害是克服化學(xué)防治方法帶來的生態(tài)環(huán)境破壞、毒害殘留等負(fù)影響的重要手段，篩選和研發(fā)生物拮抗對(duì)于安全有效防治紅提葡萄真菌病害具有重要意義[11-12]。但生物拮抗制劑在實(shí)際生產(chǎn)和加工的過程中，由于自身理化穩(wěn)定性的影響，其抑菌物質(zhì)可能會(huì)受到破壞而失活，篩選出來的拮抗菌也就不能很好地應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中，因此，拮抗菌株的穩(wěn)定性研究也十分重要[13-14]。

拮抗菌株SZ9、LT3是前期試驗(yàn)所篩選出來的對(duì)紅提葡萄常見的真菌病害均具有較好抑菌效果的菌。本研究對(duì)其抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，結(jié)果表明，兩株拮抗菌均具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性，具有進(jìn)一步研發(fā)成生物制劑的潛力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 嚴(yán)大義.紅地球葡萄[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[2] 晁無疾.紅地球葡萄優(yōu)質(zhì)無公害栽培[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

[3] 高專麗，耿有廷.提子系列葡萄栽培技術(shù)[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2004（1）：30-31.

[4] 劉會(huì)寧，李華.歐亞種葡萄對(duì)白粉病與霜霉病的抗性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：302-308.

[5] 王芬.紅提葡萄3種主要病害拮抗菌的篩選[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（12）：1 304-1 306.

[6] 王森.紅地球葡萄主要病原菌的發(fā)生與綜合防治[J].中外葡萄與葡萄酒，2002（1）：43-44.

[7] 張奇普，杜衛(wèi)東.紅地球葡萄主要病害及綜合防治措施[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（8）：33.

[8] 龔偉，戴勤，萬貴成.新疆博樂紅地球葡萄生產(chǎn)中白粉病及霜霉病的防治[J].中外葡萄與葡萄酒，2008（3）：45-46.

[9] 劉冬梅，李理.用牛津杯法測(cè)定益生菌的抑菌活力 [J]食品研究與開發(fā)，2006，27（3）：110-111.

[10] 黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：高等教育出版社，1999：13-15.

[11] Yu G，Jia X，Wen J，et al.Strain improvement of Streptomyces roseosporus for daptomycin production by rational screening of He-Ne laser and NTG induced mutants and kinetic modeling [J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2011，163（6）：729-743.

[12] Han J，Sun L，Dong X，et al.Characterization of a novel plant growth-promoting bacteria strain Delftia tsuruhatensis HR4 both as a diazotroph and a potential biocontrol agent against various plant pathogens[J].Systematic and Applied Microbiology，2005，28（1）：66-76.

[13] Hu X， Li A， Fan J，et al. Biotrestment of pnitrophenol and nitrobenzene in mixed wastewater through selective bioaugmentation[J]. Bioresource Technology，2008，99（10）：4 529-4 533.

[14] Kato S H. Stable coexistence of five bacterial strains as a cellulose-degrading community[J]. Appl Environl Mi-crobiol，2005，71（11）：7 099-7 106.