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    暗紫貝母鱗莖的組織培養(yǎng)

    2015-07-31 20:59:26張振霞張惠婷龐立志等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:氯化汞貝母鱗莖

    張振霞 張惠婷 龐立志等

    摘要:由于不合理的采挖,暗紫貝母野生資源奇缺,而植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以有效地保存暗紫貝母種質(zhì)資源,而且可以解決人工種植的種苗問題。以暗紫貝母鱗莖為外植體,通過選擇流水沖洗時(shí)間和消毒時(shí)間,研究不同激素組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果以及誘發(fā)產(chǎn)生不定芽或不定根從而長(zhǎng)成完整的植株的過程,以期建立暗紫貝母的快速無(wú)性繁殖體系。結(jié)果表明,以暗紫貝母鱗莖為外植體,先用流水沖洗3 h,經(jīng)75%乙醇表面消毒后,用0.10%氯化汞處理8 min,最后用無(wú)菌水清洗5次的效果最佳,污染率僅為7.5%;不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基配方是MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA,誘導(dǎo)率達(dá)66.7%;最佳繼代培養(yǎng)基配方同不定芽誘導(dǎo),增殖系數(shù)可達(dá)8.27;在1/2MS+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上的生根情況較好。

    關(guān)鍵詞:暗紫貝母;組織培養(yǎng);培養(yǎng)基配方;鱗莖;不定芽;誘導(dǎo);增殖;生根

    中圖分類號(hào): Q945.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)03-0017-03

    暗紫貝母(Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia)為著名中藥材川貝的主要來(lái)源之一,入藥部位為地下鱗莖,具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效[1]。暗紫貝母喜寒涼氣候,主要分布于四川省阿壩地區(qū)的海拔較高的高原與草地,生長(zhǎng)環(huán)境特殊,人工引種栽培有很多困難。另外,暗紫貝母生長(zhǎng)周期長(zhǎng),一般4~5年才可采收,而且產(chǎn)量很低,因此目前暗紫貝母的資源比較短缺,很大程度上都依賴于野生資源。經(jīng)過多年采挖,暗紫貝母的野生資源破壞嚴(yán)重,產(chǎn)量逐年減少,貨源緊缺,價(jià)格逐年攀升,因此尋找新的途徑以解決其資源問題是非常迫切的。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以從根本上解決暗紫貝母的苗種問題,成本低,見效快;此外,可以研究組培出來(lái)的暗紫貝母愈傷組織的藥效,有可能成為有效的替代技術(shù)。因此,暗紫貝母組培技術(shù)的研究在藥用植物開發(fā)研究和生產(chǎn)中具有特殊的意義和應(yīng)用潛力[2],本研究探討不同植物激素組合對(duì)暗紫貝母鱗莖不定芽誘導(dǎo)、增殖、生根情況的影響。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    暗紫貝母地下鱗莖于2012年6月采自四川省康定地區(qū)。

    以MS為基本培養(yǎng)基,附加30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂,調(diào)節(jié)pH值為5.8,添加不同濃度2,4-D、NAA、6-BA等激素。所有培養(yǎng)基均在121 ℃條件下高壓滅菌15 min。

    培養(yǎng)條件為溫度(25±1) ℃、空氣相對(duì)濕度50%~60%、光照時(shí)間12 h/d、光照度1 000~1 500 lx。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 外植體的消毒 選取白嫩、健康的新鮮貝母地下鱗莖,用自來(lái)水沖洗1~2 h,置于超凈工作臺(tái)上用75%乙醇進(jìn)行表面消毒,采用5種方式對(duì)鱗莖外植體進(jìn)行消毒處理,分別為:處理1:流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+0.05%氯化汞浸泡、振蕩 8 min;處理2:流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 8 min;處理3:流水沖洗1 h+70%乙醇處理30 s+10%次氯酸鈉浸泡、振蕩 20 min;處理4:流水沖洗3 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 8 min;處理5:流水沖洗3 h+70%乙醇處理30 s+0.10%氯化汞浸泡、振蕩 10 min。消毒后用無(wú)菌水清洗5次后接種于附加不同激素組合的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),接種2周后統(tǒng)計(jì)污染率,以期篩選出適合的滅菌方式。

    1.2.2 不同激素組合對(duì)暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)的比較 選用當(dāng)年生鱗莖作為外植體,將其切成0.5 cm大小、厚度0.2 cm左右,置于含NAA(0.5、2.0 mg/L)、6-BA(0.5、2.0 mg/L)、2,4-D(2.0 mg/L)、KT(1.0 mg/L)、TDZ(1.0 mg/L)的不同種類與濃度植物激素組合的MS培養(yǎng)基上,培養(yǎng)周期為30 d,通過統(tǒng)計(jì)和對(duì)比誘導(dǎo)效率以及生長(zhǎng)狀況,研究不同激素種類與濃度組合對(duì)暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)的影響。

    1.2.3 繼代培養(yǎng)的選擇 選用鱗莖誘導(dǎo)出的不定芽,轉(zhuǎn)移到含有NAA(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)、6-BA(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/L)的MS培養(yǎng)基中,每種培養(yǎng)基30塊,培養(yǎng)30 d后觀察記錄,比較NAA、6-BA對(duì)其繼代生長(zhǎng)的影響。

    1.2.4 暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)生根培養(yǎng) 選取生長(zhǎng)較一致且健壯、未生根的綠色鱗芽單株,轉(zhuǎn)入含NAA(0.5、2.0 mg/L)、IBA(0.5 mg/L)、6-BA(0.5、2.0 mg/L)、KT(1.0 mg/L)、TDZ(1.0 mgl/L)的1/2MS、MS生根培養(yǎng)基中,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)、出根率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同滅菌方法對(duì)暗紫貝母鱗莖消毒的效果

    由于暗紫貝母的地下鱗莖帶菌嚴(yán)重,本研究采用不同的消毒方法對(duì)暗紫貝母鱗莖進(jìn)行了滅菌,2周后比較染菌率及存活狀態(tài)。從表1可以看出,處理4、處理5的滅菌效果比較好,但是從染菌率和暗紫貝母鱗莖存活狀態(tài)明顯可以看出,方法4更適合于暗紫貝母鱗莖器官的表面滅菌。因此認(rèn)為流水沖洗3 h、0.1%氯化汞滅菌8 min、無(wú)菌水清洗5次方法的滅菌效果最佳。

    2.2 不同激素組合對(duì)暗紫貝母地下鱗莖誘導(dǎo)的影響

    暗紫貝母鱗莖切片成大小為0.5 cm、厚度為0.2 cm左右,接種在含有不同植物激素的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)20 d左右發(fā)現(xiàn)從貝母外植體切塊四周逐漸分化出小的不定芽,30 d 后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率,詳見圖1。由表2結(jié)果可知,培養(yǎng)基中不同組合配比的植物激素對(duì)鱗莖的誘導(dǎo)效率不同:在含高濃度生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上,發(fā)現(xiàn)NAA、2,4-D對(duì)于貝母鱗莖誘導(dǎo)都有明顯的促進(jìn)作用,其中MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 的出芽率達(dá)43.7%,且新生芽長(zhǎng)勢(shì)旺盛,數(shù)量多,較健壯,狀態(tài)佳。在2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上,鱗莖外植體也誘導(dǎo)出不少的新生芽,只是芽較細(xì)小。在此基礎(chǔ)上各添加 1.0 mg/L KT或TDZ,對(duì)新生芽的誘導(dǎo)促進(jìn)作用并不明顯,但是個(gè)別外植體長(zhǎng)出淺黃色的根狀物;在含KT的培養(yǎng)基上,幾個(gè)新生芽變成綠色。綜合上述研究結(jié)果可知,選擇 MS附加2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA作為暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)芽的較優(yōu)激素組合培養(yǎng)基。

    2.3 不定芽的繼代培養(yǎng)

    將暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)分化出的不定芽轉(zhuǎn)移到含有不同濃度組合NAA、6-BA的MS培養(yǎng)基中,每種培養(yǎng)基接種30個(gè),培養(yǎng)10 d后就發(fā)現(xiàn)在外植體塊上長(zhǎng)出不少新芽(圖2)。35 d 后統(tǒng)計(jì)芽數(shù),從表3可以看出:在不定芽繼代培養(yǎng)中,6-BA 和NAA的不同組合在一定程度上都能促進(jìn)暗紫貝母鱗莖不定芽的增殖,且隨著植物激素濃度的上升,增殖系數(shù)也提高;但是當(dāng)NAA、6-BA分別達(dá)到3.0 mg/L時(shí),培養(yǎng)的不定芽出現(xiàn)一定程度的玻璃化現(xiàn)象,可見植物激素能促進(jìn)誘導(dǎo)貝母鱗莖生長(zhǎng),但是使用濃度不能太高。最終選定2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA為最佳的繼代培養(yǎng)基激素組合,此條件下新生芽旺盛,增殖系數(shù)為8.27。

    2.4 生根培養(yǎng)

    本試驗(yàn)將以分化再生暗紫貝母鱗莖轉(zhuǎn)入到不同的生根培養(yǎng)基中,培養(yǎng)30 d后觀察生根結(jié)果,詳見表4、圖3。在貝母鱗莖誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)過程中,MS+2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上添加1.0 mg/L KT或1.0 mg/L TDZ,培養(yǎng)一段時(shí)間后發(fā)現(xiàn)鱗莖外植體周圍長(zhǎng)出許多鵝黃色、長(zhǎng)短粗細(xì)各異的不定根,可見貝母鱗莖生根相對(duì)容易。而在1/2MS生根培養(yǎng)基中,NAA和IBA的存在有利于生根,特別是在含 0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)10d后就長(zhǎng)出健壯的根,約83.3%的鱗莖生根密集,長(zhǎng)勢(shì)好。在1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA和1/2MS+0.5 mg/L IBA的培養(yǎng)基中,生根效果也較好。綜合比較可知,貝母鱗莖生根對(duì)培養(yǎng)成分的要求不高,試驗(yàn)過程中基本都能生根,但1/2MS+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上生根率最高,長(zhǎng)出的根更加健壯,生根速率也快。生根后鱗莖長(zhǎng)出的綠芽見圖4。

    3 結(jié)論與討論

    3.1 不同消毒方法的除菌效果

    貝母地下鱗莖帶菌嚴(yán)重,通常的消毒方法往往難以取得滿意的效果。已有研究多數(shù)是用傳統(tǒng)的滅菌方法[3-5],基本是采用70%的乙醇浸泡30 s,再用0.1%~0.2%的HgCl2處理5~8 min,最后用無(wú)菌水漂洗5~8次。本研究采用上述方法,但消毒效果都不甚理想,這主要由于貝母鱗莖通常都是 2~3 枚鱗葉相互合抱,加劇了外植體消毒處理的難度。而調(diào)整之后的消毒方法則取得不錯(cuò)的結(jié)果:將貝母地下鱗莖先用流水沖洗3 h以上,經(jīng)75%乙醇表面消毒后,再用 0.10%氯化汞振蕩8 min消毒處理,最后用無(wú)菌水清洗5次,獲得外植體的污染率為7.5%,同時(shí)且消毒劑對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響也較小。

    3.2 不同激素配比對(duì)暗紫貝母鱗莖誘導(dǎo)增殖的影響

    不定芽的產(chǎn)生主要取決于培養(yǎng)基的類型及植物激素種類與濃度的配比組合。李隆云等通過對(duì)暗紫貝母鱗莖再生組織培養(yǎng)技術(shù)的研究指出,NAA和KT的組合有利于鱗莖的誘導(dǎo)[3]。王躍華等認(rèn)為,2.0 mg/L 6-BA 和0.2 mg/L NAA組合為卷葉貝母鱗莖再生最佳條件[4]。高燕等研究發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D[5]。劉亞菊等研究了TDZ在平貝母組織培養(yǎng)中的作用,結(jié)果表明,TDZ在濃度很低時(shí)可刺激平貝母外植體脫分化和再分化[6]。選用NAA、6-BA、KT、TDZ、2,4-D這5種激素不同組合誘導(dǎo)出不定芽,結(jié)果表明,2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA組合誘導(dǎo)不定芽的生長(zhǎng)效果較好,同樣的培養(yǎng)基條件在繼代培養(yǎng)中的增殖系數(shù)為8.27,效果也最佳。

    參考文獻(xiàn):

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    [3]李隆云,周裕書,代 敏,等. 暗紫貝母鱗莖再生組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 中國(guó)中藥雜志,1995,20(2):78-80.

    [4]王躍華,代 勇,何宗晟,等. 離體培養(yǎng)條件對(duì)卷葉貝母鱗莖再生的影響[J]. 中藥材,2010,33(6):854-856.

    [5]高 燕,賀 賓,范 弢,等. 貝母愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,42(1):35-37.

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