環(huán)磷酰胺致大鼠膀胱黏膜P53／P21表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)膀胱腫瘤發(fā)生的研究

田洪成，馬良宏，馬會明，馬文智，馬 璐，李苗苗，李培軍，裴秀英，王燕蓉

（1．寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科，寧夏銀川 750004；2．寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川 750004）

環(huán)磷酰胺（cytoxan，CTX）目前作為臨床一線用藥被廣泛用于腫瘤以及自身免疫性疾病的治療［1］。然而，1971年，WORTH［2］首次報(bào)道了CTX治療淋巴瘤所致的膀胱移行上皮癌，此后，CTX導(dǎo)致泌尿系上皮腫瘤的報(bào)道相繼出現(xiàn)［3－5］。有人統(tǒng)計(jì)CTX用藥后12年膀胱癌的累積發(fā)病率高達(dá)（10．7±4．9）%［4］。目前，CTX誘導(dǎo)膀胱腫瘤的機(jī)制鮮見報(bào)道。KI67蛋白用于判斷細(xì)胞增殖活性［6］，P53基因是一種腫瘤抑制基因［7］，P21蛋白抑制細(xì)胞周期［8］。三個基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過對這三個蛋白的檢測，探討CTX誘導(dǎo)膀胱癌的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物及分組斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague Dawley，SD）大鼠6只雄性、6只雌性，共12只，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心［無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級］提供，隨機(jī)分為處理組和對照組各6只，每組雄雌各半。

1．2 主要試劑和儀器CTX購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，P53、P21抗體均購自 Abcam公司，KI67抗體購自Santa Cruz公司，山羊血清工作液、免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，上樣緩沖液、SDS－PAGE配膠試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購自完達(dá)山企業(yè)集團(tuán)乳品有限公司，二抗、超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物購自博士德生物、蛋白提取試劑盒購自凱基生物有限公司。

1．3 模型建立及標(biāo)本制備處理組大鼠給予CTX 100mg／kg腹腔注射［9］，對照組給予同等劑量的生理鹽水腹腔注射，24h后給予麻醉致死量的戊巴比妥鈉無菌取膀胱，膀胱在正中切開。解剖位左側(cè)膀胱置于－80℃保存；右側(cè)膀胱置于4%（體積分?jǐn)?shù)）的多聚甲醛中固定24h，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（5μm），用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢測。

1．4 HE染色60℃恒溫烤箱烤片2h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ10min，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ及95%、90%、85%、80%、70%乙醇各5min，水洗5min，蘇木精10min，自來水沖洗1min，1%鹽酸酒精分化10s，自來水沖洗返藍(lán)15min，0．5%伊紅染色20min，水洗浮色，70%、80%、85%、90%、95%、無水乙醇各10s、10s、3～5min、5min、5min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5min，中性樹膠封片。

1．5 免疫組織化學(xué)檢測 60℃恒溫烤箱烤片2h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ20min，100%乙醇Ⅰ、Ⅱ，95%、90%、85%、80%、70%乙醇各5min，水洗5min，PBS洗3次，每次5min。0．01mol／L枸櫞酸緩沖液抗原修復(fù)2次，每次15min，室溫充分冷卻，PBS洗3次，每次5 min。3%H2O2避光室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min。山羊血清工作液室溫封閉1h，滴加一抗（KI67／P53／P21）工 作 液 （1∶100／1∶200／1∶200），室溫30min，4℃過夜。以PBS代替一抗作為陰性對照。室溫復(fù)溫1h，PBS洗3次，每次5min。按照試劑盒說明書，滴加試劑1（聚合物輔助劑），37℃孵育20min，PBS洗3次，每次5min。滴加試劑2（辣根酶標(biāo)記山羊抗兔／小鼠IgG多聚體），37℃孵育30min，PBS洗3次，每次5min。DAB顯色。蘇木精復(fù)染，脫水、透明，中性樹膠封片。

1．6 Western blot檢測常規(guī)蛋白提取、BCA檢測蛋白濃度、添加上樣緩沖液、煮沸5min，－80℃保存。SDS－PAGE電泳；100V轉(zhuǎn)移1h轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫在搖床封閉1h；一抗孵育：將β－actin按1∶10 000比例稀釋，P53／P21／KI67按1∶1 000／1∶1 000／1∶500比例稀釋，室溫?fù)u床孵育90min，回收一抗，加入TBST洗滌3次，每次5min；二抗孵育：山羊抗兔二抗按1∶10 000稀釋，室溫?fù)u床孵育60 min，回收二抗，加入TBST洗滌3次，每次5min；滴加超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物、暗室曝光。

1．7 數(shù)據(jù)分析采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 兩組HE染色結(jié)果比較CTX處理組膀胱黏膜皺襞減少、腫脹，細(xì)胞排列雜亂，呈現(xiàn)單層分布，膀胱黏膜處呈現(xiàn)毛刺樣改變；對照組膀胱皺襞多、黏膜細(xì)胞排列均勻，呈現(xiàn)3～4層分布，表面平滑。見圖1。

圖1 兩組大鼠CTX處理后膀胱組織染色結(jié)果（HE，×200）

2．2免疫組織化學(xué)染色檢測KI67、P53、P21的蛋白表達(dá)量KI67蛋白表達(dá)主要表達(dá)在膀胱黏膜細(xì)胞的細(xì)胞核，CTX處理組明顯高表達(dá)（圖2）；P53蛋白表達(dá)主要表達(dá)在膀胱黏膜細(xì)胞的細(xì)胞核，CTX處理組明顯低表達(dá)（圖3）；P21蛋白表達(dá)在膀胱黏膜細(xì)胞的細(xì)胞核和胞漿中均有表達(dá)，CTX處理組明顯低表達(dá)（圖4）。

圖2 兩組大鼠CTX處理后KI67蛋白膀胱黏膜表達(dá)（SP，×400）

圖3 兩組大鼠CTX處理后P53蛋白膀胱黏膜表達(dá)（SP，×400）

圖4 兩組大鼠CTX處理后P21蛋白膀胱黏膜表達(dá)（SP，×400）

2．3 Western blot檢測及數(shù)據(jù)分析蛋白印跡檢測，CTX組與對照組相比，KI67蛋白表達(dá)高（圖5A）、P53蛋白表達(dá)低（圖5B）、P21蛋白表達(dá)低（圖5C），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖5 兩組KI67、P53、P21灰度定量及蛋白表達(dá)柱狀圖及其蛋白印跡檢測圖

3 討 論

CTX導(dǎo)致突變的能力很強(qiáng)，研究報(bào)道，CTX在體內(nèi)代謝可生成明丙烯醛和氯乙醛，這兩種代謝物通過消耗細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（Glutataione，GSH）引起膀胱的損傷［10］。然而，GSH的耗竭可以導(dǎo)致DNA的損傷［11］，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生［12］。

KI67基因在第10號染色體上，蛋白產(chǎn)物定位在細(xì)胞核，是一種普遍認(rèn)可的細(xì)胞增殖特異性相關(guān)核抗原，主要用于判斷細(xì)胞增殖活性，在G1后期開始表達(dá)，在S期和G2期慢慢升高，M期達(dá)到頂峰，G0期無表達(dá)，在有絲分裂結(jié)束后迅速降解消失［13］。研究發(fā)現(xiàn)，KI67在肺癌、胃癌、肝癌以及其他惡性腫瘤中均是過表達(dá)［14］。同時，KI67的表達(dá)高低對研究腫瘤的特性及預(yù)后具有重要作用［13－14］。本實(shí)驗(yàn)中，CTX處理組膀胱黏膜KI67過表達(dá)，說明CTX處理后，膀胱黏膜細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。

P53基因是目前研究最廣泛的抑癌基因，定位于人類染色體的17p13．1，是細(xì)胞生長周期中重要的負(fù)調(diào)節(jié)因子［7］。P21基因是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子家族成員之一，定位于胞質(zhì)和細(xì)胞核，其具有最廣泛的激酶抑制活性［8］。P21基因位于P53基因的下游，兩者共同構(gòu)成了細(xì)胞周期的G1檢查站［15］。當(dāng)DNA 受到損傷時，P53蛋白可以阻止DNA的復(fù)制，提供足夠的時間使得損傷的DNA修復(fù)，如果修復(fù)失敗，P53蛋白可以引起細(xì)胞凋亡，如果P53基因的兩個拷貝點(diǎn)都發(fā)生了突變，對細(xì)胞的增殖失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞的癌變［16］。P21可以抑制cyclinE－CDK2和cyclinD1－CDK4的活性，從而使得Rb蛋白不能發(fā)生磷酸化，E2F不能釋放，使細(xì)胞周期停止在G1期［17］。所以，當(dāng)DNA受損時，DNA的復(fù)制受到抑制，P53／P21發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，使得受損細(xì)胞有充分的時間修復(fù)，從而減少了受損DNA的累積和復(fù)制，從而抑制腫瘤的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中，CTX處理組P53／P21表達(dá)均降低，監(jiān)管DNA的復(fù)制抑制解除，可以使得DNA不用經(jīng)過G1期的監(jiān)測而直接進(jìn)入G2期，從而造成受損DNA的累積，增加癌變的可能。同時，P53可刺激Cipt基因產(chǎn)生相對分子質(zhì)量為21×103的蛋白，該蛋白可以抑制促使細(xì)胞通過細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂的酶的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長表達(dá)［16］。本實(shí)驗(yàn)中，P53表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞生長抑制解除，膀胱黏膜細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。

KI67在G1后期開始表達(dá)，它的高表達(dá)間接證明了CTX處理后，膀胱黏膜細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)入G1期后的數(shù)量增多。P53／P21的低表達(dá)使得監(jiān)測G1期DNA復(fù)制的修復(fù)能力嚴(yán)重下降，從而使得CTX處理后，膀胱黏膜細(xì)胞損傷DNA的復(fù)制和累積增多，從而導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。同時，有研究報(bào)道，CTX所致的膀胱癌患者均有較長的用藥史，短者9個月，長著達(dá)到11年［18］。在臨床上CTX導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的危險性在停藥后可以持續(xù)數(shù)年［19］。這就為受損DNA的復(fù)制和積累提供了充足的時間，為腫瘤的發(fā)生提供了時間上的可能性。

總之，大鼠膀胱黏膜CTX處理后膀胱黏膜中KI67的高表達(dá)，P53／P21的低表達(dá)，為CTX誘導(dǎo)膀胱癌的發(fā)生提供了相關(guān)的機(jī)制。但是，疾病的發(fā)生是受多因素影響的，其他相關(guān)機(jī)制需要繼續(xù)的探索。

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