哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達(dá)的關(guān)系

張夢(mèng)瑩，徐蕓蕓，吳靜，張盼，張淡宜，彭靜靜，齊晨，紀(jì)曉昀，夏圣，蘇兆亮，王勝軍，許化溪

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)系，江蘇鎮(zhèn)江212013）

哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達(dá)的關(guān)系

張夢(mèng)瑩，徐蕓蕓，吳靜，張盼，張淡宜，彭靜靜，齊晨，紀(jì)曉昀，夏圣，蘇兆亮，王勝軍，許化溪

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)系，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：檢測(cè)哮喘小鼠肺組織中Nuocytes相關(guān)指標(biāo)和GITR-GITRL的表達(dá)，探討哮喘時(shí)Th2極化微環(huán)境的改變。方法：選擇8只Balb/c小鼠，隨機(jī)分為2組，模型組于第1天，第11天用OVA致敏，第22至26天用2%OVA溶液霧化激發(fā)，對(duì)照組用PBS處理；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織內(nèi)GITR表達(dá)和Nuocytes細(xì)胞數(shù)量；qRT-PCR法檢測(cè)Foxp3、RORα、ICOS、ST2、IL-5、IL-13和GITR及其配體GITRL的mRNA表達(dá)水平；對(duì)GITR-GITRL和Nuocytes及其相關(guān)分子的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中Nuocytes細(xì)胞數(shù)和GITR表達(dá)均升高，且GITRL、Foxp3、RORα、ICOS、ST2以及IL-5和IL-13 mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào)；GITR與RORα和ST2、IL-5、IL-13的表達(dá)水平均呈正相關(guān)。結(jié)論：哮喘小鼠肺組織中Nuocytes和GITR-GITRL表達(dá)增高，提示哮喘時(shí)GITR-GITRL上調(diào)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答可能與Th2主導(dǎo)的免疫失衡和Nuocytes極化相關(guān)。

Nuocytes；GITR；GITRL；哮喘；小鼠

哮喘是一種慢性過(guò)敏性氣道炎癥，病理特征主要表現(xiàn)為急性可逆性支氣管氣流受限、支氣管-肺組織高反應(yīng)性、氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)、黏液分泌增多等。目前，普遍認(rèn)為機(jī)體哮喘時(shí)的免疫狀態(tài)向Th2型偏倚［1］，表現(xiàn)為2型細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子IL-4、GATA3等表達(dá)水平升高。

近來(lái)發(fā)現(xiàn)一新型固有淋巴細(xì)胞Nuocytes［2-3］或稱Ⅱ型固有免疫細(xì)胞（Group 2 innate lymphoid cells，ILC2s），在哮喘疾病中起重要作用。Nuocytes經(jīng)IL-25、IL-33刺激活化，產(chǎn)生和分泌大量細(xì)胞因子，如IL-5和IL-13等。Nuocytes不表達(dá)T/B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等特異性標(biāo)志，可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulator，ICOS）為陽(yáng)性［4-5］，維甲酸相關(guān)孤核受體α（retinoid acid receptor related orphan receptorα，RORα）是其分化和發(fā)揮生物學(xué)作用必需的轉(zhuǎn)錄因子。Nuocytes主要免疫作用是參與Th2應(yīng)答過(guò)程，其極化可能是構(gòu)成Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化的重要因素。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein，GITR）是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族成員之一［6-8］，為Ⅰ型跨膜蛋白，1997年由Nocentini等在雜交瘤細(xì)胞株上克隆出，其配體即GITRL。表達(dá)有GITR的Treg細(xì)胞能有效地發(fā)揮免疫抑制作用，控制和維持機(jī)體的免疫平衡。而當(dāng)GITR與其配體GITRL共表達(dá)時(shí)，GITR-GITRL的相互作用則可消除Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，并作為免疫應(yīng)答的正向協(xié)同刺激信號(hào)，參與免疫性疾病的炎癥損傷過(guò)程。本研究擬通過(guò)檢測(cè)哮喘小鼠肺組織GITRGITRL和Nuocytes的分布以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，分析GITR-GITRL對(duì)Nuocytes及其相關(guān)分子表達(dá)水平的影響，從區(qū)域免疫學(xué)的角度了解哮喘時(shí)Th2極化微環(huán)境的變化。

1 材料與方法

1.1 小鼠哮喘模型的建立

SPF（Specific pathogen-free）級(jí)雌性Balb/c小鼠（6～8周齡）8只，購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：No.201403201。隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組4只。模型組建模方法參照文獻(xiàn)［9］并加以改進(jìn)，即于第1天和第11天腹腔注射致敏液0.1 mL［50μg雞卵清蛋白（OVA）+10%氫氧化鋁凝膠2 mg］，第22天至第26天以無(wú)菌PBS配制的2%OVA溶液超聲霧化吸入60 min，最后一次霧化吸入24 h后處死小鼠。對(duì)照組用PBS處理。

1.2 試劑

OVA（Sigma公司），Trizol試劑（Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）；GITR和Lin單克隆抗體（eBioscience公司），ST2、ICOS單克隆抗體（Biolegend公司）。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織GITR的表達(dá)和Nuocytes細(xì)胞數(shù)

取小鼠肺組織，剪碎并用膠原酶消化，篩網(wǎng)過(guò)濾和ACK裂解液裂解紅細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用抗GITRAPC或抗Lineage-FITC、抗ICOS-PerCP/Cy5.5和T1/ST2-PE作熒光抗體染色，然后用C6流式細(xì)胞儀分析。

1.4 RNA提取、引物設(shè)計(jì)及qRT-PCR

剪取約1/4肺組織塊沖洗，剪碎后加1 mL Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR（反轉(zhuǎn)錄和定量試劑均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品）。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每份標(biāo)本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔并作3次重復(fù)檢測(cè)。引物均用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)（表1），由上海生工生物技術(shù)公司合成。

表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad軟件。組間數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 哮喘小鼠模型誘導(dǎo)結(jié)果

建模后哮喘小鼠表現(xiàn)為煩躁不安，弓背且腹部鼓動(dòng)明顯，點(diǎn)頭樣喘息，呼吸加深加快等；HE染色鏡下可見(jiàn)哮喘小鼠肺泡間及伴行血管周?chē)写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜皺壁減少、杯狀細(xì)胞肥大增生，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，OVA模型組血清總IgE水平明顯升高（t=2.427，P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 模型組小鼠肺組織的病理改變（HE染色×10）

圖2 小鼠血清總IgE水平比較

2.2 肺組織Nuocytes數(shù)量和GITR表達(dá)水平的改變

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織內(nèi)GITR陽(yáng)性細(xì)胞增加，且伴有Nuocytes細(xì)胞數(shù)增多；免疫熒光抗體染色結(jié)果也顯示GITR表達(dá)增強(qiáng)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織GITR mRNA表達(dá)水平明顯升高。見(jiàn)圖3。

圖3 小鼠肺組織內(nèi)GITR表達(dá)和Nuocytes細(xì)胞數(shù)量

2.3 哮喘小鼠肺組織GITRL和Nuocytes相關(guān)分子的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中GITRLmRNA水平明顯高于對(duì)照組；此外，F(xiàn)oxp3以及Nuocytes細(xì)胞相關(guān)分子ICOS、ST2、RORα、IL-5和IL-13 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05）。見(jiàn)圖4。

2.4 哮喘小鼠肺組織GITR與Nuocytes相關(guān)分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，GITR表達(dá)與RORα，ST2，IL5和IL-13的表達(dá)呈明顯正相關(guān)（P均＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖4 GITR-GITRL和Nuocytes相關(guān)分子的mRNA表達(dá)

圖5 GITR與nuocytes相關(guān)分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析

3 討論

支氣管哮喘是以氣道過(guò)敏性炎癥為主要病理特征的免疫性疾病，近年來(lái)歐共體呼吸健康調(diào)查（ESRHS）和國(guó)際兒童哮喘與變態(tài)反應(yīng)研究機(jī)構(gòu)（ISAAC）的流行病學(xué)調(diào)查研究均顯示，哮喘患病率明顯升高。迄今為止，哮喘的病理機(jī)制尚不完全清楚。研究表明，哮喘患者體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞處于失衡狀態(tài)，Th2細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)分化［10］。Nuocytes可分泌大量的IL-5和IL-13，支撐和維持著Th2細(xì)胞的極化狀態(tài)，促進(jìn)哮喘的發(fā)展。

GITR組成性地高表達(dá)于Treg細(xì)胞表面，而靜息的初始CD4+T細(xì)胞表面表達(dá)量相對(duì)較低，當(dāng)抗原刺激活化T細(xì)胞后，Treg和CD4+T細(xì)胞表面的GITR表達(dá)量均會(huì)增高［11-13］。在缺乏足夠GITRL時(shí)，高表達(dá)GITR的Treg細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)控作用，而GITR與其配體GITRL結(jié)合則構(gòu)成T細(xì)胞活化的協(xié)同刺激信號(hào)，GITR-GITRL的相互作用影響Treg細(xì)胞的增殖及其免疫抑制功能［8-9］。

本研究顯示，哮喘小鼠肺組織內(nèi)GITR表達(dá)和Nuocytes數(shù)量升高；GITR及其配體GITRLmRNA表達(dá)水平相伴上調(diào)，同時(shí)nuocytes相關(guān)分子ICOS、ST2、IL-5、IL-13及轉(zhuǎn)錄因子RORα的mRNA水平也明顯升高；GITR-GITRL表達(dá)量與Nuocytes細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子水平呈正相關(guān)。由此推測(cè)，GITR和GITRL相伴高表達(dá)，一方面可阻礙Treg細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控作用，另一方面可能對(duì)Th2細(xì)胞極化發(fā)揮促進(jìn)作用。有研究表明，Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3是炎癥條件下穩(wěn)定Foxp3（Treg轉(zhuǎn)錄因子）表達(dá)及功能的正調(diào)控因子［14-15］，而Treg細(xì)胞中Foxp3也可通過(guò)上調(diào)去泛素化酶USP21的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而維持GATA3蛋白的穩(wěn)定性［16］。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠肺組織Foxp3 mRNA呈高表達(dá)，由此可見(jiàn)其促進(jìn)Th2細(xì)胞的極化。GITR-GITRL高表達(dá)與Nuocytes相關(guān)細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)呈正相關(guān)，可能是直接地相互影響，也可能是間接作用的結(jié)果，但最終都導(dǎo)致Th2細(xì)胞極化之微環(huán)境，構(gòu)成哮喘的免疫失衡狀態(tài)，其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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Relationship between increased nuocytes and GITR-GITRL expression levels in lung tissue of asthmatic m ice

ZHANGMeng-ying，XU Yun-yun，WU Jing，ZHANG Pan，ZHANG Dan-yi，PENG Jing-jing，QIChen，JIXiao-yun，XIA Sheng，SU Zhao-liang，WANG Sheng-jun，XU Hua-xi
（Department of Immunology，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To detect the changes of numbers of nuocytes and levels of GITR-GITRL in the lung of asthmaticmice，analyze the relationship between them，then to explore the changes of Th2-polarized micro-environment at the locus of allergic inflammation when with asthma.M ethods：Eightmice were devided into 2 groups randomly，asthmamodelswere sensitized with OVA on 1st，11st day，then nebulized inhalation with OVA on day 22-26，control group with PBS.Flow cytometry was used to detect numbers of nuocytes and cellswhich express GITR；qRT-PCR was also used to test themRNA levels of GITR-GITRL，molecules and cytokines associated with nuocytes；pearson correlation analysiswas used to detect the correlation between GITR-GITRL and nuocytes.Results：Compared with the control group，model group showed high levels of nuocytes and GITR-GITRL，meanwhile，with increased mRNA levels of GITRL，F(xiàn)oxp3，RORα，ICOS，ST2，IL-5 and IL-13；and there was a positive correlation between GITR expression and RORα，ST2，IL-5，IL-13 expression.Conclusion：Nuocytes and the expression of GITR-GITRL increased synchronously in lung of asthmaticmice，which suggested that the up-regulation of T cell-mediated immune response by GITR-GITRLmay be associated with Th2-biased response and polarization of nuocytes.

nuocytes；GITR；GITRL；asthma；mice

張夢(mèng)瑩（1990—），女，碩士研究生；蘇兆亮（通訊作者），副教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：szl30@yeah.net；許化溪（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：xuhx@ujs.edu.cn

R562.25

A

1671-7783（2015）04-0277-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150099

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31270947）

2015-05-06 ［編輯］ 劉星星