鄰苯二甲酸二辛酯和砷聯合暴露對小鼠的神經毒性及其機制

吳雪山，趙婷，茆廣華，吳向陽，周兆祥，鄒艷敏，鄒燁，Samuel Jerry Cobbina，劉紅陽，仰榴青

（江蘇大學1.化學化工學院，2.環(huán)境與安全工程學院，3.藥學院，4.食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

鄰苯二甲酸二辛酯和砷聯合暴露對小鼠的神經毒性及其機制

吳雪山1，趙婷1，茆廣華2，吳向陽2，周兆祥1，鄒艷敏3，鄒燁4，Samuel Jerry Cobbina2，劉紅陽2，仰榴青1

（江蘇大學1.化學化工學院，2.環(huán)境與安全工程學院，3.藥學院，4.食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：研究鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）和砷（As）聯合暴露對小鼠的神經毒性及其初步作用機制。方法：將40只清潔級雄性3周齡ICR小鼠隨機分為4組，即空白對照組、DOP組（1 000 mg/kg，灌胃）、As組（10 mg/L，飲用）和DOP+As組（DOP 1 000mg/kg，As10mg/L）。各組暴露8周后，采用Morris水迷宮實驗測試小鼠學習記憶能力，原子吸收法檢測腦組織As含量，采用蛋白質印跡法檢測小鼠海馬組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達，采用試劑盒檢測超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、一氧化氮合酶（NOS）活性以及丙二醛含量。結果：與空白對照組比較，各暴露組小鼠逃避潛伏期均明顯升高，平均穿越平臺的次數明顯減少（P＜0.05），小鼠腦組織As含量顯著增加（P＜0.05），腦SOD和AChE活性顯著降低，NOS活性和丙二醛含量明顯升高（P＜0.05）；海馬組織Bax和Caspase-3蛋白表達量明顯升高，Bcl-2蛋白表達量明顯減少（P＜0.05），Bax/Bcl-2值顯著提高。結論：As和DOP均可引起機體氧化損傷，導致細胞凋亡，從而產生神經毒性；而兩者聯合暴露毒性復雜，協同作用、拮抗作用和無交互作用并存，其聯合作用的機制有待進一步研究。

鄰苯二甲酸二辛酯；砷；聯合暴露；神經毒性；小鼠

鄰苯二甲酸酯（PAEs）也稱酞酸酯，常作為工業(yè)生產中塑料、樹脂和橡膠類制品的增塑劑［1-2］，其中鄰苯二甲酸二辛酯（dioctyl phthalate，DOP）是用量較大的增塑劑。同時，DOP也是一種環(huán)境激素類化合物，可轉移至環(huán)境中，從而危害人類健康。2001年，我國把DOP列為優(yōu)先控制污染物之一［3］。砷（As）是廣泛分布于自然界中的重金屬污染物，可通過多種途徑進入人體，產生毒性作用，如生殖毒性、神經毒性等［4-5］。因此，DOP和As同時暴露往往危害人類健康。本文采用行為學、酶學和蛋白質印跡法等方法，研究DOP和As聯合暴露對小鼠的神經毒性及初步作用機制，并采用析因分析方法評價其聯合毒性作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

TU1800紫外 可見分光光度計（北京普析通用儀器公司）；BS124S電子天平（賽多利斯工業(yè)稱重設備有限公司）；Synergy HT酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

DOP和NaAsO2購自國藥集團化學試劑有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛試劑盒、乙酰膽堿酯酶（AChE）試劑盒和一氧化氮合酶（NOS）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3和β-肌動蛋白單克隆抗體（山羊抗兔）均購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。

1.2 動物

清潔級雄性3周齡ICR小鼠40只，體質量（13.00±2.00）g，購于江蘇大學動物實驗中心，合格證編號：SYXK（SU）2013-0036。實驗前適應性喂養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)溫度為（24±1）℃，濕度為55%～60 %，光照周期為12～12 h。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計 將小鼠隨機分為4組，即空白對照組、DOP組（1 000 mg/kg）［6］、As組（10 mg/L）［7］和DOP+As組（DOP 1 000 mg/kg，As 10 mg/L）。DOP灌胃暴露，每天1次，As飲用水暴露，并記錄各組飲水量，各組暴露時間均為8周，隔天稱重并記錄。

暴露結束后，進行水迷宮行為學測試。測試結束后，摘眼球取血后處死，迅速取腦、肝臟、腎臟和海馬組織，-18℃保存，備用。

1.3.2 水迷宮實驗 采用Morris水迷宮測試法［8］測定各暴露組對小鼠學習記憶能力的影響。其中，定位航行實驗測定小鼠學習能力，空間探索實驗測定小鼠記憶能力。

1.3.3 小鼠腦組織As含量的測定 取小鼠腦組織0.1 g，分別加入8 mL濃硝酸和2 mL高氯酸，硝化，稀硝酸定容至10 mL。采用原子吸收法［9］測定小鼠腦組織的As含量。

1.3.4 組織病理學觀察 取小鼠海馬組織，制成切片，將切片經過蘇木精和伊紅染色液染色后，于光學顯微鏡（Axioskop 40，Zeiss，德國）下觀察海馬組織的結構形態(tài)。

1.3.5 酶活性測定 取小鼠腦組織，冰浴條件下制成10%腦組織勻漿液，備用。采用4種酶檢測試劑盒分別測定小鼠腦組織SOD、NOS、AChE的活性和丙二醛含量（具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行）。

1.3.6 蛋白質印跡法檢測Bax，Bcl-2和Caspase-3的表達 取100 mg海馬組織，加入制好的總蛋白提取液1 mL，將腦組織制成勻漿后14 000 r/min離心5 min，取上清；制備分離膠和積層膠，根據蛋白濃度的測定結果，每孔加20μg蛋白，電泳，封閉，孵一抗、二抗，顯色，曝光。采用Quantity One圖像分析軟件對圖像進行分析。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 DOP和As聯合暴露對小鼠體質量的影響

DOP和As聯合暴露對小鼠體質量的影響見表1。與對照組比較，DOP和As單獨暴露對小鼠體質量均無明顯影響（P＞0.05）。從第4周開始，與空白組、DOP組和As組比較，DOP+As暴露組小鼠的體質量明顯降低（P均＜0.05）?？梢?，DOP和As聯合暴露可在一定程度上抑制小鼠的生長。析因分析表明，DOP和As聯合暴露對小鼠體質量存在交互作用（協同作用，P＜0.05）。

表1 DOP和As聯合暴露對小鼠體質量的影響n=10，±s，g

表1 DOP和As聯合暴露對小鼠體質量的影響n=10，±s，g

a：P＜0.05，與其他3組比較，b：P＜0.05，聯合暴露存在交互作用

組別 初始 第4周 第8周空白對照組12.78±0.22 25.19±0.44 34.94±0.33 DOP組 13.07±0.19 24.46±0.39 34.56±0.44 As組 12.92±0.49 24.77±0.32 34.72±0.17 DOP+As組 13.09±0.26 24.44±0.32a 33.58±0.19a，b F值 0.655 4.590 12.099 P值0.602 0.038 0.002

2.2 DOP和As聯合暴露對小鼠學習記憶能力的影響

與對照組比較，DOP組、As組和DOP+As組小鼠逃避潛伏期明顯增加（P＜0.05），平均穿越平臺的次數明顯減少（P＜0.05）；與As組比較，DOP+ As組小鼠逃避潛伏期明顯增加，平均穿越平臺的次數明顯減少；DOP+As組與DOP組小鼠逃避潛伏期和平均穿越平臺的次數間的差異無統計學意義。見圖1?？梢姡珼OP和As聯合暴露可影響小鼠學習記憶能力。析因分析表明，DOP和As聯合暴露對小鼠逃避潛伏期和平均穿越平臺的次數均無交互作用（P＞0.05）。

2.3 DOP和As聯合暴露對小鼠腦組織As含量的影響

原子吸收法檢測結果顯示，DOP+As組與As組As含量分別為（5.93±0.26）μg/g，（5.92± 0.28）μg/g，均明顯高于DOP組［（1.14±0.25）μg/g］和空白對照組［（1.53±0.30）μg/g］，差異有統計學意義（P＜0.05）。析因分析表明，DOP和As聯合暴露對小鼠腦組織As含量不存在交互作用（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠水迷宮測試結果

2.4 小鼠海馬組織病理學變化

HE染色顯示，與空白對照組比較，DOP組、As組和DOP+As組小鼠海馬區(qū)發(fā)生了明顯的病理學改變，如CA1區(qū)的錐體細胞和齒狀回區(qū)的顆粒細胞排列松散，形態(tài)不規(guī)則且細胞邊緣不清晰。見圖2。

圖2 DOP和As聯合暴露對小鼠海馬組織齒狀回和CA1區(qū)的影響（HE染色×20）

2.5 小鼠腦組織SOD、NOS、AChE活性和丙二醛的含量

與對照組比較，DOP、As和DOP+As暴露組小鼠腦組織總NOS和誘導型NOS（iNOS）活性明顯升高，丙二醛含量明顯增加（P均＜0.05），而SOD活性明顯降低（P＜0.05），DOP和DOP+As暴露組AChE活性明顯降低（P＜0.05）；DOP+As組丙二醛、AchE含量和總NOS活性均明顯高于As組（P均＜0.05），丙二醛含量和總NOS活性顯著高于DOP組（P＜0.05）?？梢奃OP和As單獨及聯合暴露均可致小鼠產生氧化應激。析因分析表明，DOP和As聯合暴露對小鼠腦組織AChE活性存在交互作用（拮抗作用，P＜0.05），而對小鼠腦組織SOD、NOS活性和丙二醛含量均無交互作用（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠腦組織SOD、NOS、AChE活性和丙二醛含量的比較 n=10，±s

表3 各組小鼠腦組織SOD、NOS、AChE活性和丙二醛含量的比較 n=10，±s

a：P＜0.05，與空白對照組比較；b：P＜0.05，與DOP組比較；c：P＜0.05，與As組比較；d：P＜0.05，聯合暴露存在交互作用

組別 SOD（U/mg） 丙二醛（μg/mg） AChE（μg/mg） 總NOS（U/mg） iNOS（U/mg ）空白對照組 26.05±0.60 9.81±0.56 0.305±0.021 10.91±0.7 0.002 0.000 0.000 0.000 0.010 5.02±0.55 DOP組 22.18±0.97a 12.31±0.42a 0.251±0.014a 13.56±1.45a 6.87±1.67a As組 23.23±0.95a 12.29±0.70a 0.299±0.018 13.10±0.55a 6.78±0.51a DOP+As組 20.34±1.40a 13.92±0.33a，b，c 0.243±0.014a，c，d 14.79±1.31a，b，c 7.51±0.54a F值 13.409 31.898 32.005 28.743 7.634 P值

2.6 小鼠海馬組織Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的變化

蛋白質印跡檢測結果顯示，與對照組比較，DOP、As和DOP+As暴露組小鼠海馬組織Bax蛋白和Caspase-3蛋白的表達量均明顯上調（P＜0.05），而Bcl-2表達量顯著下調（P＜0.05），Bax/Bcl-2值顯著提高（P＜0.05）；DOP+As組Bax和Bcl-2蛋白的表達與DOP組間的差異均有統計學意義，與As組間則無明顯差異（圖3、4）。析因分析表明，DOP和As聯合暴露對小鼠海馬組織Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達不存在交互作用。

圖3 DOP和As聯合暴露對Bax和Bcl-2表達的影響及Bax/Bcl-2的變化

圖4 DOP和As聯合暴露對小鼠海馬組織Caspase-3表達的影響

3 討論

DOP和As單獨暴露對人體健康均有害，且DOP和As同時攝入的概率非常高，比如飲水、食物攝取等，因此，研究DOP和As的聯合毒性對人類健康具有重要的現實意義。

砷化合物進入血液以后，主要與血紅蛋白中的珠蛋白和血漿蛋白結合，通過血液循環(huán)轉運至體內各組織。本文結果表明，與對照組比較，As暴露組小鼠腦組織As含量顯著升高（P＜0.05），DOP和As聯合暴露對小鼠腦組織As含量不存在交互作用?？梢?，As可蓄積于腦組織中，研究結果與王曉旭［10］的報道一致。

氧化應激可影響神經突觸的可塑性，枝蔓狀結構和神經的形成，可導致神經類疾病，如血管性癡呆、阿爾茨海默病等［11］。As暴露可致抗氧化損傷，從而引發(fā)神經細胞凋亡。SOD是一種重要的抗氧化酶，可催化超氧化物通過歧化反應轉化為氧氣和過氧化氫酶，抗氧化應激［12］。丙二醛是自由基氧化分解的終極產物，是氧化應激產生的指示器［13］。Shila等［14］研究發(fā)現As暴露能引起小鼠體內抗氧化酶活性下降，脂質過氧化水平及丙二醛含量升高，同時腦組織內的自由基介質變性，小腦、海馬回和大腦皮質層等部位的SOD、過氧化氫酶均呈下降趨勢。在本實驗中，與對照組相比，DOP、As和DOP+ As暴露組小鼠腦組織SOD活性均顯著降低（P＜0.05），丙二醛含量顯著增加（P＜0.05）；與As組相比，DOP+As組丙二醛含量顯著增加，與DOP組相比，差異無統計學意義?？梢姡珼OP和As單獨及聯合暴露可致小鼠氧化應激增強，從而損傷其抗氧化系統。析因分析表明，DOP和As聯合暴露對小鼠腦SOD活性和丙二醛含量無交互作用。

中樞神經遞質是調節(jié)機體生理活動的重要物質基礎。AChE是一種參與乙酰膽堿代謝且具有調節(jié)膽堿突觸功能的酶，在學習記憶方面具有重要作用［15］，其活性是As神經毒性的重要指標。研究表明［16］，NO過多會致神經元損傷，甚至出現局部出血。NOS分布在腦組織，其活性被認為是產生NO的一種指示器。在本實驗中，與對照組相比，DOP、As和DOP+As暴露組小鼠腦組織AChE活性顯著降低（P＜0.05），總NOS和iNOS活性顯著升高（P＜0.05）；與As組相比，DOP+As組AchE含量和總NOS活性均顯著增加，與DOP組相比，差異無統計學意義。神經遞質的變化可為神經系統毒性提供實驗依據，這種變化可影響小鼠神經行為，即學習記憶能力。本研究中水迷宮實驗結果表明，暴露組小鼠學習記憶能力明顯低于空白對照組（P＜0.05）。因此，抗氧化系統的損傷和神經遞質的變化可能是導致小鼠學習記憶能力下降的原因。此外，析因結果說明DOP和As聯合暴露對小鼠腦AchE含量存在拮抗作用，對NOS活性不存在交互作用。

細胞凋亡不僅具有重要的生物學意義，而且具有復雜的分子生物學機制。Bcl-2家族是調節(jié)凋亡的蛋白，由促進細胞凋亡的蛋白（如Bax）和抑制細胞凋亡的蛋白（如Bcl-2）構成，其中Bax/Bcl-2的比值可反映細胞凋亡的程度［17］。Caspase家族在細胞凋亡過程中起著重要的作用，其中Caspase-3是哺乳動物體內細胞凋亡的關鍵蛋白酶。當細胞凋亡時，Caspase-3會被激活，因此檢測Caspase-3的表達可以反映出細胞凋亡情況。本研究結果發(fā)現，與對照組相比，As、DOP和As+DOP暴露組Bax的表達量顯著上調，Bcl-2顯著下調，Bax/Bcl-2值顯著升高，且Caspase-3表達量顯著增加。可見，暴露后小鼠海馬組織內Caspase-3被激活，神經細胞開始凋亡。此外，析因結果說明DOP和As聯合暴露對小鼠海馬Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達均無交互作用。

應用析因分析進行聯合毒性研究降低了分析工作量，且可有效評價兩種污染物聯合毒性，通過析因分析可容易分析出兩種污染物產生的毒性是協同，拮抗還是可以簡單相加。然而文中產生聯合作用的類型復雜，有協同作用、拮抗作用和無交互作用，因此，產生這種聯合作用的機制還有待進一步研究。

［1］ Kam rin MA.Phthalate risks，phthalate regulation，and public health：a review［J］.JToxicol Environ Health B Crit Rev，2009，12（2）：157-174.

［2］ 李幸.聚醚酯增塑劑的合成及在橡膠中應用研究［D］.廣州：華南理工大學，2012.

［3］ 史辛斌.城市污水中環(huán)境內分泌干擾物分布特征及其處理特性［D］.西安：西安建筑科技大學，2007.

［4］ Kile ML，Mazumdar M.Arsenic and development toxicity and reproductive disorders［M］//Flora SJS.Handbook of Arsenic Toxicology.Amsterdam：Elsevier Inc，2015：521-532.

［5］ Tolins M，Ruchirawat M，Landrigan P.The development neurotoxicity of arsenic：cognitive and behavioral consequences of early life exposure［J］.Ann Glob Health，2014，80（4）：303-314.

［6］ 王明霞，趙淑華，李雪，等.鄰苯二甲酸二辛酯與氯仿聯合染毒對雄性小鼠的神經毒性［J］.環(huán)境與健康雜志，2011，28（9）：782-784.

［7］ 孫寶飛，康朝勝，余資江，等.慢性砷中毒對小鼠齒狀回caspase-3表達的影響［J］.環(huán)境與健康雜志，2011，28（7）：579-582.

［8］ 宿艷敏.Morris水迷宮實驗中三種小鼠的學習能力及其性別差異［D］.石家莊：河北醫(yī)科大學，2013.

［9］ Habibi E，Ghanemi K，Fallah-Mehrjardi M，et al.A novel digestionmethod based on a choline chloride-oxalic acid deep eutectic solvent for determining Cu，Fe，and Zn in fish samples［J］.Anal Chim Acta，2013，762：61-67.

［10］ 王曉旭.亞慢性砷暴露對小鼠腦組織多種必需微量元素濃度的影響［D］.大連：大連醫(yī)科大學，2013.

［11］ 陳罕.SIRT1信號通路通過氧化應激參與大鼠慢性腦缺血致認知損傷的研究［D］.長春：吉林大學，2013.

［12］ Fang Y，Yang H，Liu B，etal.Transcriptional response of lysozyme，metallothionein，and superoxide dismutase to combined exposure to heavy metals and bacteria in Mactra veneriformis［J］.Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2013，157（1）：54-62.

［13］ Yang TC，Chen YJ，Chang SF，et al.Malondialdehyde mediates oxidized LDL-induced coronary toxicity through the Akt-FGF2 pathway via DNA methylation［J］.JBiomed Sci，2014，21：11.

［14］ Shila S，Kokilavani V，Subathra M，etal.Brain regional responses in antioxidant system toα-lipoic acid in arsenic intoxicated rat［J］.Toxicology，2005，210（1）：25-36.

［15］ 余鋒，徐波，孫立巖，等.跑臺運動緩解D-半乳糖AD大鼠學習記憶能力下降及其與海馬ChAT，AchE的關系［J］.北京體育大學學報，2013，36（3）：62 -66.

［16］ Wang CH，Hsiao CK，Chen CL，et al.A review of the epidemiologic literature on the role of environmentalarsenic exposure and cardiovascular diseases［J］.Toxicol Appl Pharm，2007，222（3）：315-326.

［17］ Xu J，Lian LJ，Wu C，et al.Lead induces oxidative stress，DNA damage and alteration of p53，Bax and Bcl-2 expressions in mice［J］.Food Chem Toxicol，2008，46（5）：1488-1494.

Neurological effects of co-exposure of dioctyl phthalate and arsenic in m ice and associated mechanism

WU Xue-shan1，ZHAO Ting1，MAO Guang-hua2，WU Xiang-yang2，ZHOU Zhao-xiang1，ZOU Yan-min3，ZOU Ye4，Samuel Jerry Cobbina2，LIU Hong-yang2，YANG Liu-qing1
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，2.School of the Environment and Safety Engineering，3.School of Pharmacy，4.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the neurological effect of exposure to individual and mixtures of dioctyl phthalate（DOP）and arsenic（As）inmice and to discuss resultant preliminarymechanisms associated with the effects.M ethodsDOP（1 000 mg/kg，i.g.）and As（10 mg/L，p.o.）were administered individually and asmixtures to 4 groups ofmice.After 8 weeks of exposure，the enzyme activity，learning and memory abilities and As content in brain ofmice were assessed by commercial kits，Morriswatermase test and Vista-MPX Simultaneous ICP-OES.The expression of Bax，Bcl-2 and Caspase-3 were performed by Western blot.Results：Mice demonstrated poorer learning and memory performance in exposure groups compared to control.The As level of brain in exposure groups were significantly increased（P＜0.05）.AChE and SOD activities decreased，however，MDA and NOS showed an increase in exposure groups compared to control.The expression of caspase-3 and Bax were significantly increased but Bcl-2 expression was inhibited in the hippocampus，and Bax/Bcl-2 increased.Conclusion：Both DOP and As can induce neurotoxicity inmice associated with hippocampal apoptosiswhich caused by oxidative stress.The joint toxicity of DOP and As was complicated.Effect of antagonism，synergistic or without interaction were all observed.Themechanism needs to be further studied.

book=295,ebook=24

dioctyl phthalate；arsenic；co-exposure；neurotoxicity；mice

X503.22

A

1671-7783（2015）04-0294-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150095

吳雪山（1989—），男，碩士研究生；仰榴青（通訊作者），教授，博士生導師，E-mail：yangliuqing@ujs.edu.cn

2015-04-28 ［編輯］ 陳海林