父源性十溴聯(lián)苯醚暴露下調(diào)雄性子鼠睪酮水平和精子數(shù)

戴瑞雪，翟金霞，任　征，丁承輝，林浩飛，李玉榮，李　俊

◇預(yù)防醫(yī)學(xué)研究◇

父源性十溴聯(lián)苯醚暴露下調(diào)雄性子鼠睪酮水平和精子數(shù)

戴瑞雪，翟金霞，任征，丁承輝，林浩飛，李玉榮，李俊

摘要目的觀察父源性（F0代雄性小鼠）十溴聯(lián)苯醚（PBDE-209）暴露對(duì)胎鼠（F1代）體格發(fā)育狀況及出生后70 （PND70）天F1代雄性子鼠臟器系數(shù)、睪酮水平、精子數(shù)和睪丸組織形態(tài)的影響。方法4周齡雄性小鼠，按小鼠每日體重進(jìn)行灌胃染毒，隨機(jī)分為玉米油組（0 mg／kg）、低劑量組（100 mg／kg）、中劑量組（300 mg／kg）和高劑量組（500 mg／kg），連續(xù)染毒6周。染毒結(jié)束前1 d與健康雌鼠1∶2合籠，觀察F1代胎鼠體格發(fā)育和PND70天F1代雄性子鼠臟器系數(shù)、睪酮水平、精子數(shù)和睪丸組織形態(tài)變化。結(jié)果高劑量組F1代胎鼠體重、體長(zhǎng)和肛殖距（肛門到生殖器距離）降低（P＜0．05），雌雄比增加（P＜0．05）；與玉米油組比較，高劑量組PND70天雄性子鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、附睪尾精子數(shù)和血清睪酮水平明顯降低（P＜0．05）；雄性仔鼠HE染色顯示中、高劑量組精子數(shù)目減少，間質(zhì)間隙明顯增寬，基底室出現(xiàn)空腔，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少等。結(jié)論F0代雄性小鼠暴露PBDE-209可能會(huì)影響F1代子鼠體格發(fā)育，還可能會(huì)使PND70天雄性子鼠的精子數(shù)、睪酮水平降低，以及睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞PBDE-209；子鼠；胎鼠；PND70；睪酮；精子數(shù)

多溴聯(lián)苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）作為一種重要的阻燃劑被廣泛應(yīng)用于紡織、塑料及電子等工業(yè)以及日用品中［1］。PBDEs共有209種同系物，常見的3種是五溴聯(lián)苯醚（penta-BDEs）、八溴聯(lián)苯醚（octa-BDEs）和十溴聯(lián)苯醚（PBDE-209）。在使用的阻燃劑總量中，PBDE-209超過80%。研究［2－4］表明，PBDE-209影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。研究［5］表明PBDE-209對(duì)子代也具有重要影響。王志新等［6］指出PBDE-209可導(dǎo)致小鼠體外受精率降低，影響受精卵的早期發(fā)育，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但是關(guān)于F0代雄性小鼠暴露PBDE-209對(duì)其子代影響的研究極少。該研究利用PBDE-209作為受試物，通過對(duì)F0代雄性ICR小鼠經(jīng)灌胃染毒，初步探討PBDE-209對(duì)F1代胎鼠體格發(fā)育及出生后70 （PND70）天雄性子鼠睪酮水平、精子數(shù)和睪丸組織形態(tài)的影響。

1　材料與方法

1．1主要試劑

PBDE-209（優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Alfa Aesar公司，貨號(hào)L04656）；睪酮ELISA試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）。

1．2動(dòng)物

清潔級(jí)健康4周齡ICR雄性小鼠44只，體重27～32 g，8周齡雌性ICR小鼠88只，體重32～35 g，安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1．3．1F0代小鼠處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，即玉米油組（0 mg／kg）、低劑量組（100 mg／kg）、中劑量組（300 mg／kg）、高劑量組（500 mg／kg），按小鼠每日體重進(jìn)行灌胃染毒。小鼠自由飲食、飲水，環(huán)境溫度25℃左右，12 h光照／12 h黑暗。每天早上八時(shí)開始染毒，每日染毒1次，連續(xù)染毒6周。染毒結(jié)束前，與雌鼠合籠。

1．3．2吸收胎數(shù)、活胎數(shù)及F1代胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育與雌雄比的檢測(cè)

F0代染毒結(jié)束前，隨機(jī)選取各組雄鼠各6只，與雌鼠按1∶2比例合籠，合2 d休1 d，持續(xù)2周。次日九時(shí)前檢查雌鼠陰道，發(fā)現(xiàn)陰栓即為受孕0天。受孕第18天時(shí)，孕鼠脫頸椎處死，剖腹檢查，取胎鼠稱重和胎盤重，計(jì)算活胎總數(shù)、每窩活胎數(shù)等，并檢查外觀，測(cè)量體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、肛殖距（肛門到生殖器距離），計(jì)算雌雄比。

1．3．3PND70天F1代子鼠的解剖與形態(tài)學(xué)

F0代小鼠染毒結(jié)束前，選取5只F0代小鼠，按上述方法進(jìn)行合籠，交配結(jié)束后，棄去雄鼠和未懷孕的雌鼠，子鼠在出生后第4天，為維持F1子鼠營(yíng)養(yǎng)均衡性，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，保持每窩8只子鼠（雌鼠4只，雄鼠4只），剔除不足8只的窩。子鼠在PND21天斷奶，將母鼠和雌性子鼠脫頸椎處死，雄性子鼠則繼續(xù)飼

2015－05－08接收

1．3．4F1代子鼠PND70天精子計(jì)數(shù)

按方法［7］計(jì)數(shù)精子，即在37℃小燒杯中剪碎附睪尾，使精子自由游出（約5 min），取適量精子懸液滴入計(jì)數(shù)板，計(jì)算精子總數(shù)。

1．3．5ELISA法檢測(cè)F1代子鼠PND70天血清睪酮的含量

取出存放于－80℃的血清樣本，室溫條件下放置30 min，試劑盒放置20 min；參照試劑盒說明書操作，計(jì)算出相應(yīng)睪酮含量，由于睪酮值不呈正態(tài)分布，經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行分析。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行建庫，采用SPSS 16．0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。各組數(shù)據(jù)間比較采用單因素ANOVA方差分析，組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)與其合籠雌鼠的生育能力及F1胎鼠的影響

2．1．1PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)受孕數(shù)、生育率、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)、每窩平均活胎數(shù)的影響

PBDE-209染毒組受孕數(shù)、生育率均高于玉米油組，每窩平均活胎數(shù)高于玉米油組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。染毒組均出現(xiàn)吸收胎，低劑量組和高劑量組均為1例，中劑量組3例和1例發(fā)育遲緩，見表1。

表1　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)受孕數(shù)、生育率、吸收胎數(shù)、活胎數(shù)和發(fā)育遲緩例數(shù)的影響

表2　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)胎鼠體格發(fā)育的影響（±s）

表2　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)胎鼠體格發(fā)育的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05；與中劑量組比較：＃P＜0．05

項(xiàng)目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝11）　　高劑量組（n＝8）體長(zhǎng)（mm）　25．128 2±1．43　24．901 3±1．28　24．813 3±1．00　24．579 7±1．63*體重（g）　1．457 9±0．14　1．426 6±0．14　1．440 2±0．16　1．398 1±0．13*＃尾長(zhǎng)（mm）　14．165 4±1．10　13．977 9±1．01　14．232 3±1．78　13．938 3±1．03胎盤（g）　0．099 0±0．02　0．177 8±0．13　0．103 2±0．02　0．121 2±0．13肛殖距（mm）　2．437 4±0．59　2．413 3±0．50　2．344 1±0．52　2．245 2±0．37*

2．1．2PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)F1代胎鼠體格發(fā)育及雌雄比的影響

高劑量組胎鼠體重、身長(zhǎng)、肛殖距均明顯低于玉米油組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝3．23、3．01、3．17，P＜0．05）；尾長(zhǎng)和胎盤重量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1．435、0．450，P＞0．05），見表2。平均每窩雌鼠數(shù)明顯增多、雄鼠數(shù)明顯減少、平均每窩雌雄比增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝2．03、1．73、2．82，P＞0．05），組間兩兩比較中顯示，與玉米油組比較，中劑量組和高劑量組的平均每窩雌鼠數(shù)和雌雄比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），高劑量組的平均每窩雄鼠數(shù)與玉米油組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表3。

2.2PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)其F1代雄性子鼠的影響

2．2．1PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)F1代PND70天雄性子鼠體重及臟器系數(shù)的影響

對(duì)PND70天雄性仔鼠的體重及各臟器系數(shù)進(jìn)行分析，顯示體重均低于玉米油組（F＝2．93，P＞0．05），與玉米油組比較，高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；腎臟系數(shù)（F＝2．36，P＞0．05）和肝臟系數(shù)（F＝5．53，P＜0．05）明顯降低，與玉米油組比較，高劑量組的腎臟系數(shù)和低、高劑量組肝臟系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0．05），腦系數(shù)、脾系數(shù)和心系數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1．98、0．95、2．95，P＞0．05），見表4。

2．2．2PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)F1代PND70天雄性子鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、精子數(shù)和血清睪酮水平的影響

解剖PND70天F1代雄性子鼠，與玉米油組比較，中劑量組和高劑量組睪丸系數(shù)（F＝5．38，P＜0．01）和附睪系數(shù)（F＝10．82，P＜0．01）降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。F1代精子數(shù)和睪酮水平隨著染毒劑量的增加而降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝1．836、2．798，P＞0．05），高劑量組與玉米油組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表5。

2．2．3PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)F1代PND70天雄性子鼠睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響

玉米油組（圖1A）生精小管排列整齊，形態(tài)規(guī)則，精子數(shù)目較多，各級(jí)生精細(xì)胞排列有序而緊密，形態(tài)正常，睪丸支持細(xì)胞均勻分布在曲細(xì)精管周圍，排列緊密。低劑量組（圖1B）支持細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)無明顯改變；中劑量組（圖1C）精子數(shù)目有所減少，睪丸支持細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞排列不緊密，支持細(xì)胞之間間隙變大。高劑量組（圖1D）精子數(shù)目減少，間質(zhì)間隙明顯增寬，生精細(xì)胞間隙增大，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少。

表3　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)胎鼠性別的影響（±s）

表3　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)胎鼠性別的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05

項(xiàng)目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝11）　　高劑量組（n＝8）平均每窩雌鼠數(shù)（n）　5．714 3±2．50　7．500 0±2．39　8．363 6±2．66*　8．375 0±2．07*平均每窩雄鼠數(shù)（n）　7．571 4±1．81　6．500 0±2．39　5．818 2±1．54　5．500 0±2．00*平均每窩雌雄比　0．810 0±0．42　1．258 8±0．54　1．541 8±0．65*　1．787 5±0．99*

表4　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)　F1雄性子鼠臟器系數(shù)的影響（±s）

表4　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)　F1雄性子鼠臟器系數(shù)的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與低劑量組比較：＃P＜0．05；與中劑量組比較：△P＜0．05

項(xiàng)目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝9）　　高劑量組（n＝7）體重（g）　47．806 7±1．916 3　47．268 0±2．863 5　45．686 7±2．750 5　44．313 3±2．179 9*大腦系數(shù)（%）　0．753 4±0．000 4　0．725 6±0．000 9　0．820 3±0．000 9　0．759 6±0．000 8腎臟系數(shù)（%）　0．820 7±0．109 1　0．734 0±0．108 0　0．729 6±0．052 4　0．680 0±0．129 3*肝臟系數(shù)（%）　5．567 8±0．366 0　4．616 5±0．376 3△　5．381 4±0．750 4?！?．614 5±0．703 4**△脾臟系數(shù)（%）　0．251 7±0．000 6　0．266 1±0．000 4　0．255 3±0．000 4　0．286 7±0．000 3心臟系數(shù)（%）　0．542 7±0．000 6　0．483 0±0．000 7　0．561 8±0．001 0 0．618 0±0．001 2

表5　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)F1雄性子鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、精子數(shù)、睪酮的影響（±s）

表5　PBDE-209染毒雄性小鼠對(duì)F1雄性子鼠睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、精子數(shù)、睪酮的影響（±s）

與玉米油組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與低劑量組比較：＃P＜0．05

項(xiàng)目　　玉米油組（n＝7）　　低劑量組（n＝8）　　中劑量組（n＝11）　　高劑量組（n＝8）體重（g）　47．806 7±1．916 3　47．268 0±2．863 5　45．686 7±2．750 5　44．313 3±2．179 9*睪丸系數(shù)（%）　0．338 4±0．034 1　0．310 3±0．032 1　0．295 1±0．011 3**　0．271 7±0．040 2**附睪系數(shù)（%）　0．121 4±0．013 4　0．111 0±0．007 9　0．102 7±0．007 9**　0．088 6±0．004 9**精子數(shù)（×106／ml）　34．730 0±3．251 7　31．800 0±2．041 2　31．230 0±3．636 4　29．560 0±1．847 5*睪酮（pg／m l）　2．667 5±0．045 4　2．660 8±0．059 5　2．612 2±0．075 6　2．550 0±0．035 7*＃

3　討論

我國(guó)是PBDEs生產(chǎn)和使用大國(guó)［8］。流行病學(xué)資料［9］顯示，PBDEs已經(jīng)被證明在環(huán)境介質(zhì)和生物樣本，包括人體生物樣本中檢測(cè)出，并且含量呈上升趨勢(shì)。PBDE-209屬于內(nèi)分泌干擾物，對(duì)生物的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有嚴(yán)重的損傷作用。對(duì)生殖系統(tǒng)的影響，特別是對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的影響逐漸引起重視。前期研究［10］表明PBDE-209可以引起雄性小鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)的降低，同時(shí)精子數(shù)和睪酮水平隨著暴露劑量的增加顯著降低。研究［11－12］表明親代低劑量暴露PBDE-209不僅影響F0代的生長(zhǎng)和生殖，也會(huì)改變F1代的性腺、甲狀腺激素以及神經(jīng)行為學(xué)的改變。與He et al［10］結(jié)果一致，該研究顯示染毒雄性小鼠致雌鼠受孕數(shù)增加，子鼠出生數(shù)量增加，并且各染毒組均出現(xiàn)吸收胎，中劑量組出現(xiàn)3例；染毒組胎鼠的體重、體長(zhǎng)和肛殖距均低于玉米油組，并且雌鼠數(shù)明顯增加，雄鼠數(shù)明顯降低，平均每窩雌雄比顯著增加，這些結(jié)果表明F0代暴露PBDE-209可能對(duì)F1代胎鼠體格發(fā)育以及性別的形成具有影響。

目前為止，為數(shù)極少的關(guān)于F0代PBDE-209染毒對(duì)F1代影響的研究中F0代處理方式集中在孕期和孕前期暴露。比如梁辰等［5］報(bào)道，孕期暴露PBDE-209可影響雌性子代大鼠的生殖發(fā)育。本研究主要是用PBDE-209染毒雄性小鼠，在對(duì)雌鼠沒有繼續(xù)染毒的情況下觀察F1代PND70天雄性小鼠的發(fā)育、睪酮水平、精子數(shù)和睪丸形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果顯示體重和經(jīng)體重校正后的睪丸系數(shù)、附睪系數(shù)、腎臟系數(shù)、肝臟系數(shù)顯著降低；大腦系數(shù)、脾臟系數(shù)和心臟系數(shù)增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明PBDE-209染毒雄性小鼠可能對(duì)PND70天子鼠的臟器系數(shù)具有一定的影響。進(jìn)一步研究顯示精子數(shù)和血清睪酮含量顯著降低，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞數(shù)減少，支持細(xì)胞與生精細(xì)胞間隙增寬。Tseng et al［13］指出PBDE-209孕期暴露可引起PND71天的雄性子鼠精子H2O2含量增加以及DNA損傷。王志新等［14］發(fā)現(xiàn)外源性暴露PBDE-209可使小鼠精子DNA損傷，引起精子DNA鏈斷裂，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系。但目前關(guān)于PBDE-209染毒F0代雄性小鼠對(duì)F1代影響的機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，PBDE-209染毒雄性F0代小鼠可能對(duì)與其合籠雌性小鼠的生育能力及F1代胎鼠體格發(fā)育產(chǎn)生影響，出現(xiàn)吸收胎和發(fā)育遲緩，F(xiàn)1代胎鼠的體格發(fā)育指標(biāo)低于玉米油組，雌雄比增加，并且F1代PND70天雄性子鼠的精子數(shù)和血清睪酮水平降低，由于本研究樣本量有限，需要大樣本量作進(jìn)一步的研究，其機(jī)制還有待深入探討。

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中圖分類號(hào)R 994

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1438－05

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1408085MH192）；安徽醫(yī)科大學(xué)博士科研資助基金（編號(hào)：XJ201201）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，合肥230032

作者簡(jiǎn)介：戴瑞雪，女，碩士研究生；翟金霞，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zhaijinxia＠sina．com養(yǎng)至PND70天，眼球取血，然后脫頸椎處死，冰浴上取睪丸、附睪、腦、肝、腎等臟器并稱量重量，同時(shí)取附睪尾計(jì)數(shù)精子，睪丸行HE染色。

Decrease of testosterone levels and sperm count in m ale offspring by paternal exposed to decabromodiphenyl ether

Dai Ruixue，Zhai Jinxia，Ren Zheng，et al
（Dept of Occupational and Environmental Health，School of Public Health，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo observe the physical developmentof fetalmice（F1fetalmice）and the organ coefficient，testosterone levels，sperm count and testicular tissuemorphology of F1male offspring after birth 70（PND70）days by the paternal（F0male mice）exposing to decabromodiphenyl ether（PBDE-209）．Methods4-week-old male mice were infected according to the daily body weight and divided into the corn oil group（0 mg／kg），low dose group（100 mg／kg），middle dose group（300 mg／kg）and high dose group（500 mg／kg）random ly．Mice wereexposed to PBDE-209 by gavage for 6 weeks．They were put togetherwith healthy femalemice for copulation as the ratio 1∶2 before the end of gavage．To observe the physical development of F1fetalmice and the organ coefficient，testosterone levels，sperm countand testicular tissuemorphology of F1male offspring after birth 70（PND70）days．ResultsIn the high dose group，the body weight，length and anogenital distance（distance between the anus to the genitals）of F1fetalmice were reduced（P＜0．05），and the ratio of female versemale increased（P＜0．05）；compared with the control group，the testis coefficient，epididymis coefficient，liver coefficient and kidney coefficient of the high-dose group PND70 male offspring were decreased（P＜0．05），and the sperm count in the tail of epididymal and serum testosterone levels were reduced significantly（P＜0．05）；in the middle and high dose groups，the number of sperm countwas reduced，the interstitial spacewaswidened significantly，vacuolus appeared in the base compartment，and the number of sertoli cells and leydig cellswas reduced in themale fetalmice by HE staining．ConclusionF0malemice exposed to PBDE-209 may affect the physical development of F1fetalmice，andmay cause the reduction of sperm count and testosterone levels and testicularmorphological change of PND70 male offspring．

Key wordsPBDE-209；offspring；fetalmice；PND70；testosterone；sperm count