二甲雙胍對MCF-7腫瘤細胞系SP細胞的抑制作用

劉 暢，周恩相

（福建省腫瘤醫(yī)院，福州350014）

二甲雙胍對MCF-7腫瘤細胞系SP細胞的抑制作用

劉 暢，周恩相

（福建省腫瘤醫(yī)院，福州350014）

目的 研究二甲雙胍、紫杉醇脂質(zhì)體、他莫昔芬對人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞系SP細胞的殺傷作用及相互的協(xié)同效應。方法 將二甲雙胍（0.3 mmol/L）、紫杉醇脂質(zhì)體（60.0 μg/L）、他莫昔芬（10.0 μmol/L）分別對MCF-7腫瘤細胞進行單一或聯(lián)合干預，并應用流式細胞儀分析SP細胞比例。結(jié)果 空白對照組、二甲雙胍組、紫杉醇脂質(zhì)體組、他莫昔芬組、二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇脂質(zhì)體組、二甲雙胍聯(lián)合他莫昔芬組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例各不相同，二甲雙胍干預各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例分別較其余各組下降，差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.01）；二甲雙胍干預各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例兩兩比較及非二甲雙胍干預各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 0.3 mmol/L二甲雙胍可有效殺滅人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞系SP細胞；二甲雙胍與紫杉醇脂質(zhì)體或他莫昔芬聯(lián)用未表現(xiàn)出協(xié)同效應。

乳腺，人； 乳腺腫瘤； 細胞系，腫瘤； 二甲雙胍； 他莫昔芬； SP細胞； 紫杉醇脂質(zhì)體

作為臨床治療2型糖尿病最常用的藥物之一，二甲雙胍（metformin，Met）可降低多種惡性腫瘤的患病風險和死亡率[1]。有研究證實，Met抑制乳腺癌細胞增殖的通路為激活磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK），對雌激素受體陽性和陰性的乳腺癌細胞均有生長抑制和細胞周期停滯作用[2-3]，并可縮小荷瘤裸鼠腫瘤體積及延長緩解期[4-5]。流行病學調(diào)查也表明，長期服用Met可降低乳腺癌發(fā)生率并改善患者預后[6-7]。本研究測定了SP細胞在人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞系中的比例，旨在探討Met、紫杉醇脂質(zhì)體（paclitaxel liposome，Taxol）、他莫昔芬（tamoxifen，TAM）對人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞系SP細胞的殺傷作用及相互的協(xié)同效應，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞系為云南大學昆明醫(yī)學院提供，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM）/F12復合培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO公司，L-谷氨酰胺、赫希司特33342染料（Hoechst33342）、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、維拉帕米（Verapamil）、TAM原藥粉劑購自Sigma公司，0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜購自鼎國生物技術(shù)有限公司，Met原藥粉劑購自湘雅制藥有限公司，Taxol原藥粉劑購自思科藥業(yè)有限公司，EPICS ALTRA流式細胞儀購自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM/F12復合培養(yǎng)基培養(yǎng)MCF-7腫瘤細胞（37℃、5%二氧化碳、飽和濕度）。

1.2.2 實驗分組 取對數(shù)生長期MCF-7腫瘤細胞，分別加入Met、Taxol、TAM，使三者分別達0.3mmol/L、60.0μg/L、10.0 μmol/L。分為空白對照組、Met組、Taxol組、TAM組、Met聯(lián)合Taxol組、Met聯(lián)合TAM組。

1.2.3 細胞染色 將經(jīng)藥物干預24h的細胞以0.1mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）離心洗滌2次（1 000 r/min離心5 min）；用DMEM/F12復合培養(yǎng)基重懸細胞；將細胞懸液分為兩組，一組加入5 μg/mL Hoechst33342，一組加入 5 μg/mL Hoechst33342和50 μg/mL Verapamil；水浴90 min（37℃恒溫），搖勻；加入PBS終止反應，離心2次（1 000 r/min離心5 min），加入含2%胎牛血清PBS混勻；各組細胞加入PI（2μg/mL）。

1.2.4 SP分析 用流式細胞儀分析各組SP細胞比例，以355 nm波長激發(fā)Hoechst33342，用610 nm數(shù)字信號處理系統(tǒng)分色，450/40 nm帶通收集藍光，655 nm長通收集紅光；以488 nm波長激發(fā)PI，575/26 nm帶通收集紅光。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表表示，采用最小顯著差數(shù)法兩兩比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例 空白對照組無VerapamilMCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例為（4.62±0.39）%?？瞻讓φ战M有Verapamil MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例為（0.97±0.10）%，二者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）?？鄢瞻讓φ战M有Verapamil顯示的失活或死亡細胞比例即為MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例 [（3.65± 0.42）%]，見圖1。

圖1 人乳腺癌MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例

2.2 各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較 各組有、無Verapamil MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。扣除各組有Ve rapamil顯示的失活或死亡細胞比例，獲得各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例，各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較（±s表，%）

表1 各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較（±s表，%）

注：與同組無Verapamil比較，aP＜0.05。

組別空白對照組M e t組T a x o l組T A M組M e t聯(lián)合T a x o l組M e t聯(lián)合T A M組無V e r a p a m i l 有V e r a p a m i l 4 . 6 2 ± 0 . 3 9 1 . 6 0 ± 0 . 1 0 4 . 4 6 ± 0 . 1 8 4 . 6 7 ± 0 . 3 9 1 . 7 5 ± 0 . 1 3 1 . 7 3 ± 0 . 2 1 0 . 9 7 ± 0 . 1 0a0 . 8 8 ± 0 . 0 8a1 . 0 1 ± 0 . 1 7a1 . 1 2 ± 0 . 2 3a0 . 9 4 ± 0 . 1 0a0 . 8 5 ± 0 . 1 4a

表2 各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較（±s表，%）

表2 各組MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例比較（±s表，%）

注：各組間兩兩比較，aP＜0.05；與非Met干預各組比較，bP＜0.05。

試劑5%葡萄糖Met PBS Taxol TAM P 3.65±0.42a0.72±0.13ab3.45±0.32a0.74±0.16ab3.56±0.51a0.87±0.12ab＞0.05＞0.05

3 討 論

SP細胞具有自我更新、多項分化、少量成瘤的干細胞特性，可通過腺苷三磷酸結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassette superfamily G member 2，ABCG2）/乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白1的表達特異性地泵出某些染料，在熒光顯微鏡和流式細胞儀下表現(xiàn)為拒染或淡染[8-9]。本研究通過加入ABCG2抑制劑——Verapamil阻斷SP細胞的外排染料功能，甄選出由于細胞活性降低、死亡導致的低染及拒染細胞，從而得到較為準確的MCF-7腫瘤細胞系SP細胞比例。本研究使用的355 nm紫外光位于 Hoechst33342的最佳激發(fā)波長范圍之內(nèi)（350～366 nm），相較于其他研究所使用的408 nm紫光所得的SP細胞比例較低，接近于國外相關(guān)研究結(jié)果[10-11]。

作為經(jīng)實踐證明可有效抑制MCF-7腫瘤細胞增殖的乳腺癌治療常用藥物的Taxol和TAM在本研究選取的小于半數(shù)有效劑量濃度并不能有效殺滅SP細胞。選用的0.3 mmol/L Met可抑制乳腺癌細胞生長，但對非轉(zhuǎn)化乳腺上皮細胞無抑制作用[12-13]，結(jié)果顯示，該濃度Met可有效殺滅MCF-7腫瘤細胞系SP細胞，較之目前臨床常用的乳腺癌治療藥物，Met具有新的特點和優(yōu)勢，對抑制乳腺癌干細胞藥物的研究具有重要意義。

本研究設置了Met分別與Taxol、TAM聯(lián)合干預組，且兩組均可有效殺滅SP細胞。但未得出上述藥物聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同作用的結(jié)果。Met與各藥物聯(lián)用能否在常規(guī)療程內(nèi)提高乳腺癌療效、藥物改性或合理搭配是否能進一步提高抗腫瘤作用尚有待于更深入的研究。

Met治療糖尿病時的血藥濃度一般維持于0.0028～0.015 0 mmol/L[14]，而本研究濃度遠高于正常治療值。有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度Met并不能影響AMPK的表達水平[4]，亦有研究顯示，只有長期持續(xù)應用Met的乳腺癌患者才可顯現(xiàn)益處，多數(shù)患者用藥時間達 5～10年[7]。由此可見，現(xiàn)有有效研究結(jié)果與臨床安全用藥范圍存在較大差距，綜合考慮療效及不良反應，Met尚未達到治療乳腺癌的臨床應用標準。

同時作者注意到作為經(jīng)濟而簡便的研究腫瘤干細胞的方法，SP法也具有一定的局限性，有研究表明，干細胞特性并不會體現(xiàn)在所有SP細胞中，SP表型也不會出現(xiàn)在所有腫瘤干細胞中[15-16]。SP法對實驗條件要求十分嚴格，所使用的熒光染料Hoechst33342對許多細胞具有毒性作用，在實驗中需根據(jù)研究對象的不同選擇影響最小的染料濃度和適當?shù)膶嶒灜h(huán)境，以期獲得更加準確的結(jié)果。

參考文獻

[1]Zhang P，Li H，Tan X，et al.Association of metformin use with cancer incidence and mortality：a meta-analysis[J].Cancer Epidemiol，2013，37（3）：207-218.

[2]Queiroz EA，Puukila S，Eichler R，et al.Metformin induces apoptosis and cell cycle arrest mediated by oxidative stress，AMPK and FOXO3a in MCF-7 breast cancer cells[J].PLoS One，2014，9（5）：e98207.

[3]Hadad SM，Hardie DG，Appleyard V，et al.Effects of metformin on breast cancer cell proliferation，the AMPK pathway and the cell cycle[J].Clin Transl Oncol，2014，16（8）：746-752.

[4]Rocha GZ，Dias MM，Ropelle ER，et al.Metformin amplifies chemotherapyinduced AMPK activation and antitumoral growth[J].Clin Cancer Res，2011，17（12）：3993-4005.

[5]Hirsch HA，Iliopoulos D，Tsichlis PN，et al.Metformin selectively targets cancer stem cells，and acts together with chemotherapy to block tumor growth and prolong remission[J].Cancer Res，2009，69（19）：7507-7511.

[6]Bosco JL，Antonsen S，Sorensen HT，et al.Metformin and incident breast cancer among diabetic women：a population-based case-control study in Denmark[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20（1）：101-111.

[7]Bodmer M，Meier C Kr?henbühl S，et al.Long-term metformin use is associated with decreased risk of breast cancer[J].Diabetes Care，2010，33（6）：1304-1308.

[8]Wu CP，Zhou L，Xie M，et al.Identification of cancer stem-like side population cells in purified primary cultured human laryngeal squamous cell carcinoma epithelia[J].PLoS One，2013，8（6）：e65750.

[9]Teshima K，Nara M，Watanabe A，et al.Dysregulation of BMI1 and micro-RNA-16 collaborate to enhance an anti-apoptotic potential in the side population of refractory mantle cell lymphoma[J].Oncogene，2014，33（17）：2191-2203.

[10]Britton KM，Meyre R，Harvey IJ，et al.Breast cancer，side population cells and ABCG2 expression[J].Cancer Lett，2012，323（1）：97-105.

[11]Patrawala L，Calhoun T，Schneider-Broussard R，et al.Side population is enriched in tumorigenic，stem-like cancer cells，whereas ABCG2+and ABCG2-cancer cells are similarly tumorigenic[J].Cancer Res，2005，65（14）：6207-6219.

[12]Liu B，F(xiàn)an Z，Edgerton SM，et al.Metformin induces unique biological and molecular responses in triple negative breast cancer cells[J].Cell Cycle，2009，8（13）：2031-2040.

[13]Alimova IN，Liu B，F(xiàn)an Z，et al.Metformin inhibits breast cancer cell growth，colony formation and induces cell cycle arrest in vitro[J].Cell Cycle，2009，8（6）：909-915.

[14]Rizos CV，Elisaf MS.Metformin and cancer[J].Eur J Pharmacol，2013，705（1/2/3）：96-108.

[15]Singh S，Bora-Singhal N，Kroeger J，et al.βArrestin-1 and Mcl-1 Modulate Self-Renewal Growth of Cancer Stem-Like Side-Population Cells in Non-Small Cell Lung Cancer[J].PLoS One，2013，8（2）：e55982.

[16]Golebiewska A，Bougnaud S，Stieber D，et al.Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells[J]. Brain，2013，136（Pt 5）：1462-1475.

Inhibitory effect of metformin on SP cells in tumor cell line MCF-7

Liu Chang，Zhou Enxiang
（Fujian Provincial Tumor Hospital，F(xiàn)uzhou 350014，China）

ObjectiveTo investigate the killing effect of metformin，paclitaxel liposome and tamoxifen on SP cells in tumor cell line MCF-7 and their mutual synergistic effects.MethodsThe MCF-7 cells were performed the single or combined intervention with metformin（0.3 mmol/L），paclitaxel liposome（60.0 μg/L）and tamoxifen（10.0 μmol/L）respectively.The proportion of SP cells was tested by flow cytometry.ResultsThe proportions of SP cells in tumor cell line MCF-7 were different among the blank control group，metformin group，paclitaxel liposome group，tamoxifen group，metformin combined with paclitaxel liposome group and metformin combined with tamoxifen group，which in the metformin intervention groups was decreased compared with other groups，the differences were statistically significant（P＜0.01）；the proportion of SP cells had no statistical differences in the pairwise comparisons among the metformin intervention groups and the non-metformin intervention groups（P＞0.05）.Conclusion0.3 mmol/L metformin can effectively kill SP cells in tumor cell line MCF-7；the combined use of metformin with paclitaxil liposome or tamoxifen has no synergistic effects.

Mammary glands，human； Breast neoplasms； Cell line，tumor； Metformin； Tamoxifen； SP cells；Paclitaxil liposomen

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.008

A

1009-5519（2015）24-3709-03

2015-10-30）

劉暢（1984-），男，福建南平人，碩士研究生，主要從事腫瘤外科臨床工作；E-mail：darcyliu1984@live.com。