應(yīng)用多功能熒光酶標(biāo)儀分析鹽酸阿霉素含藥量

侯玉群，胡姍姍，宋長(zhǎng)偉，董 偉，惠 景，朱欣婷，范 芳，劉 云

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000）

應(yīng)用多功能熒光酶標(biāo)儀分析鹽酸阿霉素含藥量

侯玉群，胡姍姍，宋長(zhǎng)偉，董 偉，惠 景，朱欣婷，范 芳，劉 云

（遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000）

目的 建立應(yīng)用多功能熒光酶標(biāo)儀對(duì)鹽酸阿霉素（多柔比星）含藥量直接進(jìn)行熒光分析的方法。方法在體系為0.050 mol/L氨丁三醇（pH 6.30）條件下設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為495、595 nm，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定鹽酸阿霉素?zé)晒庵?。結(jié)果 鹽酸阿霉素為0.78～25.00 μM時(shí)熒光強(qiáng)度呈良好線性（R2=0.979），加樣回收率達(dá)97.97%以上。該法用于測(cè)定SD大鼠血樣中鹽酸阿霉素時(shí)回收率為98.30%～98.80%。結(jié)論 該法具有較好的準(zhǔn)確度與靈敏度，適用于鹽酸阿霉素含藥量測(cè)定及在血樣中的分析測(cè)定。

多柔比星/血液； 氨丁三醇； 大鼠，Sprague-Dawley； 血清； 多功能熒光酶標(biāo)儀

鹽酸阿霉素（doxorubicin hydrochloride）又稱為鹽酸多柔比星，是一種在臨床上被廣泛應(yīng)用的蒽環(huán)類抗癌類藥物，抗癌譜廣，可用于治療肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌等[1-2]。因其具有較強(qiáng)的心臟毒性、骨髓抑制及消化道不良反應(yīng)，常需監(jiān)測(cè)其在體內(nèi)的藥物濃度，以調(diào)整化療方案從而達(dá)到理想的療效。目前，對(duì)鹽酸阿霉素的檢測(cè)方法有紫外檢測(cè)法、高效液相色譜法和熒光檢測(cè)法；其中普通的熒光分光光度法具有靈敏度高、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)；但樣品的檢測(cè)通量很低，只能對(duì)單一樣品逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，并且檢測(cè)所需樣本量也較大，給前期收集處理樣本帶來了麻煩[3-7]。因此，本研究嘗試采用多功能熒光酶標(biāo)儀同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)微量樣品的連續(xù)檢測(cè)，以提高檢測(cè)效率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 鹽酸阿霉素（美國(guó)Sigma公司）、注射用鹽酸（深圳萬樂藥業(yè)有限公司）、VARIOSKAN FLASH多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、pHS-2C型精密酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、精密電子天平（德國(guó)Sartorious公司）等。SD大鼠（雄性，體質(zhì)量 250 g，清潔級(jí)）由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK渝2007-0005）。

1.2 方法

1.2.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 稱取58 mg鹽酸阿霉素用氨丁三醇（pH 6.30）[8]溶解后定容于100.0 mL容量瓶中，得到1.00 mM的貯備液，放置于4℃下保存。每次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確移取適量?jī)?chǔ)備液，配制所需的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 確定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)

1.2.2.1 固定發(fā)射波長(zhǎng) 在400～600 nm波長(zhǎng)范圍掃描發(fā)射光譜，確定鹽酸阿霉素所合適檢測(cè)的發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.2.2 固定激發(fā)波長(zhǎng) 在520～700 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜，確定鹽酸阿霉素所合適檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)。

1.2.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用二倍稀釋法配制25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 μM鹽酸阿霉素溶液，各取200.0 μL加入96孔板黑色酶標(biāo)板，用多功能熒光酶標(biāo)儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度。設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為595 nm檢測(cè)熒光強(qiáng)度，

1.2.4 檢測(cè)注射用鹽酸阿霉素 稱取注射用鹽酸阿霉素1.5、2.0、3.0 mg用氨丁三醇（pH 6.30）溶解后定容于50.0 mL容量瓶中。采用多功能熒光酶標(biāo)儀直接測(cè)定各樣品熒光值，平行檢測(cè)5孔，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含藥量。

1.2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取注射用鹽酸阿霉素6.5 mg，用氨丁三醇（pH 6.30）溶解后定容于100.0 mL容量瓶中。分別量取10.0 mL鹽酸阿霉素注射劑溶液，置于3個(gè)50.0 mL容量瓶中，分別加入1.00 mM鹽酸阿霉素溶液2.0、4.0、6.0 mL，用氨丁三醇（pH 6.30）定容，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，平行檢測(cè)3次，取平均值，然后計(jì)算回收率。

1.2.6 SD大鼠血樣中鹽酸阿霉素加樣回收實(shí)驗(yàn) 將1.2 mL SD大鼠血清移入 5.0 mL離心管中分別加入0.10、0.15、0.20 mM鹽酸阿霉素標(biāo)準(zhǔn)液2.0 mL，再分別加入1.2 mL乙腈，于高速離心機(jī)中離心沉淀除去蛋白。取離心后上清液，再加入氨丁三醇（pH 6.30）定容于25.0mL容量瓶中進(jìn)行回收率測(cè)定試驗(yàn)[7]。

2 結(jié) 果

2.1 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng) 在495 nm附近出現(xiàn)明顯吸收峰，固定激發(fā)波長(zhǎng)為495 nm；在595 nm處出現(xiàn)明顯發(fā)射峰。鹽酸阿霉素的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為495、595 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 鹽酸阿霉素為0.78～25.00 μM時(shí)具有較好線性關(guān)系，線性方程為Y=1.835X+7.44，R2=0.979；式中：Y為熒光強(qiáng)度，X為鹽酸阿霉素含藥量。

2.3 鹽酸阿霉素注射劑中鹽酸阿霉素的含藥量 鹽酸阿霉素注射劑含藥量為12.00%，且不同樣品量檢測(cè)出的鹽酸阿霉素含藥量基本一致，見表1。

表1 鹽酸阿霉素注射劑含藥量

2.4 鹽酸阿霉素注射劑加樣回收率 注射用鹽酸阿霉素含藥量加樣回收率均在97.97%以上，見表2。

2.5 SD大鼠血清中鹽酸阿霉素加樣回收率 SD大鼠血清中鹽酸阿霉素加樣回收率均在98.00%以上，見表3。

表2 鹽酸阿霉素注射劑加樣回收率

表3 SD大鼠血清中鹽酸阿霉素加樣回收率

3 討 論

本研究建立了一種多功能熒光酶標(biāo)儀快速定量檢測(cè)鹽酸阿霉素的方法。該方法的特點(diǎn)是利用氨丁三醇（pH 6.30）穩(wěn)定檢測(cè)體系，鹽酸阿霉素的線性檢測(cè)范圍為0.78～25.00 μM；且能對(duì)SD大鼠血清中含有的鹽酸阿霉素進(jìn)行有效檢測(cè)。多功能熒光酶標(biāo)儀所需血樣量只有熒光分光光度計(jì)的1/10且可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本，適用于臨床樣本的快速檢測(cè)。

[1]Liu X，Chen Z，Chua CC，et al.Melatonin as an effective protector against doxorubicin-induced cardiotoxicity[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002，283（1）：H254-263.

[2]國(guó)家醫(yī)藥管理局醫(yī)藥工業(yè)情報(bào)中心站.新藥指南[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1989：458-459.

[3]江崇球，高明霞.鹽酸表阿霉素與牛血清白蛋白相互作用的研究及藥物在血清與尿樣中含量的測(cè)定[J].光譜學(xué)與光譜分析，2003，23（5）：937-940.

[4]Gilbert CM，F(xiàn)ilippich LJ，McGeary RP，et al.Pharmacokinetics of doxorubicinol in dogs[J].J Vet Pharmacol Ther，2006，29（5）：433-435.

[5]Lewis AL，Taylor RR，Hall B，et al.Pharmacokinetic and safety study of doxorubicin-eluting beads in a porcine model of hepatic arterial embolization[J].J Vasc Interv Radiol，2006，17（8）：1335-1343.

[6]趙剛，胡增華，黃力明，等.熒光光譜法測(cè)定人血漿中國(guó)產(chǎn)阿霉素濃度及臨床藥代動(dòng)力學(xué)觀察[J].云南醫(yī)藥，1994，15（5）：377-379.

[7]Piall E，Aherne GW，Marks V.Evaluation of a commercially available radioimmunoassay kit for measurement of doxorubicin in plasma[J].Clin Chem，1982，28（1）：119-121.

[8]李桂云.熒光分析法測(cè)定注射用鹽酸阿霉素的含量[J].中國(guó)藥物與臨床，2013，13增刊：26-27.

Application of multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument in analyzing doxorubicin hydrochloride content

Hou Yuqun，Hu Shanshan，Song Changwei，Dong Wei，Hui Jing，Zhu Xinting，F(xiàn)an Fang，Liu Yun
（Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563000，China）

ObjectiveTo establish a direct fluorometric analytical method by using the multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument for detecting the doxorubicin hydrochloride content.MethodsUnder the condition of the system as 0.050 mol/L tromethamine，the excitation wavelength and emission wavelength were set as 495 nm and 595 nm，the multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument was used to detect the fluorometric value of doxorubicin hydrochloride.ResultsThe fluorescence intensity of doxorubicin hydrochloride had a good linearity when doxorubicin was 0.78-25.00 μM（r2=0.979），the recovery rate was above 97.97%.The recovery rate was 98.30%-98.80%when detecting the recovery rate of doxorubicin in SD rat blood sample.ConclusionThe established method has better accuracy and sensitivity，and is suitable for the determination of doxorubicin hydrochloride content and the analytic determination of blood sample.

Doxorubicin/blood； Tromethamine； Rats，Sprague-Dawley； Serum； Multifunctional fluorescent enzyme-labeled instrument

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.24.002

A

1009-5519（2015）24-3692-02

2015-09-02）

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY[2013]3008）；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（黔教合KY字[2014]212）；遵義醫(yī)學(xué)院招標(biāo)項(xiàng)目（F-614）。

侯玉群（1989-），男，山東菏澤人，在讀碩士研究生，主要從事抗癌藥物載體開發(fā)的研究；E-mail：zz10001@qq.com。

劉云（E-mail：liuyunzy@126.com）。