人參皂苷Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

曹夢園，趙月鳴，張晶，趙剛

（1.吉林省醫(yī)學(xué)期刊社，吉林長春130061；2.吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，吉林長春130021；3.福建省廈門市第二醫(yī)院檢驗科，福建廈門361024；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射生物教研室，吉林長春130021）

·論著·

人參皂苷Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)癡呆大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響

曹夢園1，趙月鳴2，張晶3，趙剛4

（1.吉林省醫(yī)學(xué)期刊社，吉林長春130061；2.吉林省腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科，吉林長春130021；3.福建省廈門市第二醫(yī)院檢驗科，福建廈門361024；4.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射生物教研室，吉林長春130021）

目的應(yīng)用Aβ25-35誘導(dǎo)并建立癡呆大鼠模型，觀察人參皂苷Rb1對海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用。方法選取Sprague Dawley大鼠42只，采用隨機數(shù)字表法分為模型組、治療組及正常組，每組14只。模型組和治療組建立Aβ25-35誘導(dǎo)癡呆大鼠模型，治療組大鼠實驗前、造模后7 d給予20 mg/（kg·d）人參皂苷Rb1，模型組和正常組給予等體積的生理鹽水灌胃。建立模型喂養(yǎng)7 d后，Morris水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶力進行后處死大鼠，末端標記法（TUNEL）檢測大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，免疫組織化學(xué)法檢測大鼠海馬神經(jīng)元細胞周期蛋白D1、Fas、FasL水平及凋亡相關(guān)基因Survivin、Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平。結(jié)果模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶力較正常組大鼠明顯降低，而Rb1治療組大鼠的學(xué)習(xí)記憶力較模型組明顯改善（P＜0.05）；治療組大鼠細胞周期蛋白D1陽性率為（38.60±5.02）％，高于模型組[（19.81±5.74）％]均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組大鼠凋亡細胞陽性率為（47.33±7.92）％，低于模型組[（72.68±9.80）％]，均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組Fas、FasL和Bax蛋白陽性率分別為（56.42±8.17）％、（44.27±6.35）％和（52.09±7.10）％，低于模型組，均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組Bcl-2、Survivin和p53蛋白陽性率分別為（61.53±5.92）％、（53.19±8.24）％和（59.16±8.79）％，高于模型組，均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論人參皂苷Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)的癡呆大鼠記憶力及認知功能具有保護作用，降低海馬神經(jīng)元的損傷和凋亡，并通過下調(diào)Fas、FasL和Bax蛋白的表達水平，增加Bcl-2、Survivin和p53蛋白的陽性表達而發(fā)揮作用。

人參皂苷Rb1；Aβ25-35；癡呆大鼠；海馬神經(jīng)元；凋亡

人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分。有研究認為人參皂苷Rb1能夠清除氧自由基、抗細胞凋亡，對缺氧、缺血狀況下的神經(jīng)元具有保護、修復(fù)作用，但人參皂苷Rb1是否也參與對海馬神經(jīng)元的保護，是否能改善記憶、增強中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，報道尚不多見[1-2]。本研究旨在應(yīng)用Aβ25-35誘導(dǎo)并建立癡呆大鼠模型，觀察人參皂苷Rb1對海馬神經(jīng)元凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1動物和分組

選取6周齡清潔級（Sprague Dawley，SD）大鼠（吉林大學(xué)動物實驗中心）42只，雌雄各半，平均體重（198.72±13.41）g。采用隨機數(shù)字表法分為3組：正常組、模型組及治療組，每組14只。

1.2建模及方法

模型組和Rb1治療組建立Aβ25-35誘導(dǎo)癡呆大鼠模型，將Aβ25-35溶解于無菌生理鹽水中，配制成2 g/L，置于37℃水浴箱中3 d，10％氯胺酮腹腔注射麻醉，在腦立體定位儀下注射3μl Aβ25-35于大鼠側(cè)腦室[3]。連續(xù)3 d腹腔注射青霉素10萬u/d，其中治療組大鼠實驗前、造模后1周給予人參皂苷Rb1 20 mg/（kg·d）[（溶劑為生理鹽水，相當于成人劑量為1 mg/（kg·d），1次/d，模型組和正常組均給予等體積的生理鹽水灌胃，建立模型后連續(xù)喂養(yǎng)7 d。

1.3主要儀器及試劑

Olympus顯微鏡購于南京伊若達儀器設(shè)備有限公司，Aβ25-35購于上海士鋒生物科技有限公司，人參皂苷Rb1（質(zhì)量分數(shù)≥96.0％）購自南京替斯艾么中藥研究所），腦立體定位儀購于北京拜安吉科技有限公司，F(xiàn)as、FasL、Survivin、Bcl-2、Bax及p53蛋白免疫組織化學(xué)法試劑盒購自美國Sigma公司，Morris水迷宮購自北京智鼠多寶公司。

1.4觀察指標及檢測方法

1.4.1 Morris水迷宮實驗建立模型喂養(yǎng)7 d后，首先完成水迷宮實驗，實驗內(nèi)容包括定位航行實驗和空間探索實驗評估大鼠的學(xué)習(xí)記憶力，驗證癡呆大鼠成模與否及嚴重程度。圓形水池直徑160 cm，高50 cm，池中水深30 cm，池底黑色，水溫保持在（23±2）℃；池壁標記4個等距離點N、E、S、W作為實驗的起始點，分水池為4個象限，任選—象限在中央放置與池壁圓心距離相等黑色平臺，直徑12 cm，高29 cm，沒于水下1 cm。應(yīng)用自動攝像及Xmaze分析系統(tǒng)實時跟蹤記錄動物運動軌跡。實驗訓(xùn)練階段將大鼠置于迷宮內(nèi)訓(xùn)練4次/d，并適應(yīng)環(huán)境，連續(xù)3 d后進行學(xué)習(xí)和記憶功能檢測[4]。定位航行實驗記錄大鼠的逃避潛伏期，空間探索實驗記錄大鼠第3象限停留時間。水迷宮實驗結(jié)束后處死大鼠，迅速取出大腦海馬部位，置于4％甲醛浸泡約24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，連續(xù)切片，進行凋亡及相關(guān)蛋白表達檢測。

1.4.2 大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及相關(guān)蛋白表達檢測采用末端標記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）檢測大鼠海馬神經(jīng)元的凋亡，應(yīng)用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（streptavidin-perosidase，SP）檢測大鼠海馬神經(jīng)元細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、Fas、FasL水平及凋亡相關(guān)基因Survivin、Bcl-2、Bax及p53蛋白表達水平[5]。其中Cyclin D1、Fas、FasL 3種指標用來評價大鼠神經(jīng)元凋亡程度，抑制凋亡基因Survivin、Bcl-2、p53及促進凋亡基因Bax的表達水平，用來評價并判斷大鼠海馬神經(jīng)元凋亡水平及Rb1抗凋亡的可能機制，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，在高倍鏡下（×400），每張切片隨機選擇5個清晰的視野，每個視野選擇100個細胞并計數(shù)陽性細胞，陽性率=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)（500）×100％。2位資深的病理醫(yī)生同時進行免疫組織化學(xué)結(jié)果判定，意見統(tǒng)一后確診。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，3組間比較用方差分析，組間兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶力比較

模型組大鼠學(xué)習(xí)和記憶力較正常組大鼠明顯下降，給予Rb1治療后，大鼠的學(xué)習(xí)和記憶力提高，但仍較正常組大鼠降低（P＜0.05）。見表1。

2.2各組大鼠腦組織凋亡率比較

治療組大鼠TUNEL陽性率低于模型組，但兩組均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3各組Cyclin D1蛋白陽性率比較

治療組大鼠Cyclin D1陽性率高于模型組，但均低于正常組，模型組Cyclin D1陽性率低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.4各組大鼠Fas、FasL、Survivin、Bcl-2、Bax和p53蛋白比較

治療組Fas、FasL和Bax蛋白陽性率低于模型組，但均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；治療組Bcl-2、Survivin和p53蛋白陽性率高于模型組，但均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶力、Cyclin D1和TUNEL陽性率結(jié)果比較（n=14±s）

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)和記憶力、Cyclin D1和TUNEL陽性率結(jié)果比較（n=14±s）

注：t1、P1：模型組與正常組比較；t2、P2：治療組與正常組比較；t3、P3：治療組與模型組比較

組別逃避潛伏期/s第3象限停留時間/sCyclin D1TUNEL陽性細胞數(shù)正常組44.16±4.8085.32±5.6958.37±7.0626.16±6.51模型組86.30±7.5959.14±7.1119.81±5.7472.68±9.80治療組71.47±6.8270.98±7.3538.60±5.0247.33±7.92t1值2.1343.3211.9833.561P1值0.0230.0140.0420.031t2值3.0122.1983.3914.961P2值0.0210.0420.0370.018t3值3.2103.9575.7823.982P3值0.0420.0430.0210.032

表2 各組大鼠Fas、FasL、Survivin、Bcl-2、Bax和p53蛋白陽性率比較（n=14，％±s）

表2 各組大鼠Fas、FasL、Survivin、Bcl-2、Bax和p53蛋白陽性率比較（n=14，％±s）

注：t1、P1：模型組與正常組比較；t2、P2：治療組與正常組比較；t3、P3：治療組與模型組比較

組別FasFasLSurvivinBcl-2Baxp53蛋白正常組20.18±6.2621.04±5.8172.38±9.0379.82±6.0240.33±6.3281.07±10.21模型組80.21±9.6369.26±8.2416.07±1.2631.60±4.8778.42±6.1838.23±9.35治療組56.42±8.1744.27±6.3553.19±8.2461.53±5.9252.09±7.1059.16±8.79t1值5.9824.9213.8524.4933.3926.291P1值0.0130.0110.0140.0170.0120.024t2值5.9213.9934.4682.2213.8797.932P2值0.0210.0440.0320.0220.0310.041t3值3.3384.4434.9475.6426.9833.239P3值0.0320.0220.0230.0350.0380.027

3 討論

認知功能障礙大多由中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變引起，甚至發(fā)展為阿爾茨海默病[6]。Aβ為β淀粉樣蛋白前體蛋白的水解產(chǎn)物，Aβ淀粉樣蛋白的沉積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[7]。海馬作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分在記憶和學(xué)習(xí)的多個環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用，也是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病最早受累的部位[8]。Aβ25-35能夠加速神經(jīng)元的凋亡程序，改變海馬超微結(jié)構(gòu)，減少海馬神經(jīng)元數(shù)量，以建立癡呆大鼠模型，影響大鼠的學(xué)習(xí)、記憶及其他神經(jīng)系統(tǒng)活動[9-10]。

本研究結(jié)果提示，Aβ25-35誘導(dǎo)的癡呆大鼠記憶力及認知功能明顯減退。其原因為Aβ25-35引起神經(jīng)元損害、認知損害和記憶功能下降，人參皂苷Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)的癡呆大鼠記憶力及認知功能有保護作用。人參皂苷Rb1是人參主要的有效成分之一，具有抗氧化損傷、保護神經(jīng)細胞及改善記憶的功能[11]。本研究結(jié)果顯示，治療組大鼠TUNEL陽性率低于模型組，治療組大鼠Cyclin D1陽性率高于模型組，提示人參皂苷Rb1能減輕大鼠海馬神經(jīng)元的損傷，促進Cyclin D1的合成，可有效保護神經(jīng)元免受Aβ25-35誘導(dǎo)的損傷。

Fas是一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）和神經(jīng)生長因子受體蛋白超家族。FasL是一種Ⅱ型膜蛋白，亦屬于TNF家族，是Fas在體內(nèi)的天然配體。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，F(xiàn)as、FasL的升高可促進細胞凋亡。Bcl-2是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，可以抑制由多種細胞毒引起的細胞死亡。Bax基因是Bcl-2基因家族的一員，其產(chǎn)物是一種與Bcl-2同源的相關(guān)蛋白，能加速細胞凋亡，拮抗Bcl-2的生物學(xué)活性。P53基因編碼一種分子量為53 kD的蛋白質(zhì)，p53基因的失活促使細胞凋亡，降低對細胞的修復(fù)功能[12-13]。本研究結(jié)果顯示，治療組Fas、FasL和Bax蛋白陽性率低于模型組，治療組Bcl-2、Survivin和p53蛋白陽性率高于模型組，提示人參皂苷Rb1能夠通過下調(diào)Aβ25-35誘導(dǎo)的癡呆大鼠的Fas、FasL和Bcl-2蛋白的表達水平，提高Bax、Survivin和p53蛋白陽性表達而發(fā)揮作用。因此，人參皂苷Rb1能夠避免神經(jīng)細胞凋亡，維持其正常形態(tài)和功能，促進神經(jīng)損傷的修復(fù)[14]。

綜上所述，人參皂苷Rb1對Aβ25-35誘導(dǎo)的癡呆大鼠記憶力及認知功能具有保護作用，降低海馬神經(jīng)元的損傷和凋亡，并通過下調(diào)Fas、FasL和Bax蛋白表達水平，提高Bcl-2、Survivin和p53蛋白的陽性表達而發(fā)揮作用。

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（申海菊 編輯）

Effect of ginsenoside Rb1 on apoptosis of hippocampal neurons in dementia rats induced by Aβ25-35

Meng-yuan CAO1,Yue-ming ZHAO2,Jing ZHANG3,Gang ZHAO4
(1.Jilin Medical Journal Community,Changchun,Jilin 130061,P.R.China;2.The Third Department of Internal Medicine,Tumor Hospital of Jilin Province,Changchun,Jilin 130021,P.R.China;3.Clinical Laboratory,the Second Hospital of Xiamen City,Xiamen,Fujian 361024,P.R.China;4.Department of Radiobiology,Public Health College of Jilin University,Changchun,Jilin 130021,P.R.China)

【Objective】To induce and establish the dementia rat model by Aβ25-35,and to observe the protective effect of ginsenoside Rb1 on the apoptosis of hippocampal neurons.【Methods】Forty-two SD rats were randomly divided into three groups by the random number table method,with 14 rats in each group.The rats in the model and Rb1 treatment groups were treated with Aβ25-35 for induction of dementia model.The rats in the Rb1 treatment group were given Rb1 20 mg/（kg·d）before and one week after model estab－lishment and those in the normal and model groups were given equal volume of normal saline by gavage.They were raised for 7 days.Morris water maze was used to detect learning and memory ability of the rats.Then the rats were sacrificed.TUNEL method was used to detect hippocampal neuron apoptosis.Immunohistochemistry was used to detect the cyclin D1,Fas and FasL levels,and apoptosis-related survivin,Bcl-2,Bax and p53 protein expression levels of hippocampal neurons.【Results】Learning and memory ability of the rats in the model group decreased compared with that in the normal group.Learning and memory ability of the Rb1 treatment group was significantly improved compared that of the model group(P＜0.05).Cyclin D1 positive rate of the Rb1 treatment group was(38.60±5.02)％,which was significantly higher than that of the model group[(19.81±5.74)％];and cyclin D1 positive rate of both groups was significantly lower than that of the normal group(P＜0.05).TUNEL positive rate of the Rb1 treatment group was(47.33±7.92)％,which was significantly lower than that of the model group[(72.68±9.80)％];both were significantly higher than that of the normal group(P＜0.05).Fas,FasL and Bax protein positive rates of the Rb1 treatment group were(56.42±8.17)％,(44.27±6.35)％and(52.09±7.10)％respectively,which were significantly lower than those of the model group,but significantly higher than those of the normal group(P＜0.05).Bcl-2,survivin and p53 protein positive rates of the Rb1 treatment group were(61.53±5.92)％,(53.19±8.24)％and(59.16±8.79)％respectively,they were significantly higher than those of the model group,but significantly lower than those of the normal group(P＜0.05).【Conclusions】Ginsenoside Rb1 has protective memory and cognitive effects on Aβ25-35-induced dementia of rat.This function might be related to alleviation of the injury and apoptosis of hippocampal neurons;down-regulation of Fas,FasL and Bax protein expressions and up-regulation of Bcl-2,survivin and p53 protein expressions.

ginsenoside Rb1;Aβ25-35;dementia rat;hippocampal neuron;apoptosis

R285.5

A

1005-8982（2015）35-0033-04

2015-08-26

趙剛，E-mail：551641812@qq.com