長(zhǎng)白山野生篤斯越橘根系內(nèi)生菌資源調(diào)查

劉鳳紅　程顯好　顧亮等

摘要：為探討長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根的形態(tài)結(jié)構(gòu)和內(nèi)生真菌的分布特征及種類(lèi)，通過(guò)壓片法對(duì)野生篤斯越橘菌根形態(tài)和內(nèi)生真菌的分布進(jìn)行了研究，并采用根段組織直接培養(yǎng)分離法和根段組織研磨培養(yǎng)分離法對(duì)根系內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離培養(yǎng)，結(jié)合真菌形態(tài)和分子生物學(xué)方法對(duì)分離菌株進(jìn)行了鑒定和多樣性分析。結(jié)果表明，野生篤斯越橘菌根侵染率高達(dá)75%；對(duì)菌絲的形態(tài)觀察得出，至少3類(lèi)不同形態(tài)的內(nèi)生真菌參與菌根的形成，粗菌絲形成致密的菌絲團(tuán)，細(xì)菌絲形成疏松的菌絲團(tuán)，疏松的粗菌絲貫穿細(xì)胞。兩種分離方法共分離得到175株內(nèi)生真菌，其中150株經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子綜合鑒定為5屬8種，其中Phialocephala spp.是優(yōu)勢(shì)屬，占菌株總數(shù)的68.57%。根段組織研磨培養(yǎng)分離法較根段組織直接培養(yǎng)分離法獲得的內(nèi)生真菌多，細(xì)菌根較粗菌根多。研究獲得的大量?jī)?nèi)生真菌資源為進(jìn)一步生物防治菌株的篩選、開(kāi)發(fā)與利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生篤斯越橘； 菌根； 內(nèi)生真菌； 形態(tài)特征； 分子鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0041-06

Abstract The mycorrhizal morphology and distribution of endophytic fungi in wild Vaccinium uliginosum Linn. in Changbai Mountain were studied through tabletting method. The endophytic fungi were isolated through root segment culturing method and grinding method， and were identified and analyzed based on fungal morphology and molecular biology technique. The results showed that the mycorrhizal infection rate was as high as 75%. According to the morphology of hyphae， the wild Vaccinium uliginosum Linn. contained at least three kinds of endophytic fungi， among which， thick hyphae formed dense hypha body， loose thick hyphae ran through the cell and thin hyphae formed loose hypha body. A total of 175 strains of endophytic fungi were isolated. Through morphology and molecular identification， 150 strains were divided into 8 species in 5 genera， among which， Phialocephala spp. was the dominant genera with the frequency of 68.57%. The amount of endophytic fungi isolated by root segment grinding method was larger than that of root segment culturing method， and that isolated from thin mycorrhiza was larger than that from thick mycorrhiza. The isolation of plentiful endophytic fungi laid foundations for further screening， development and utilization of bio-control strains.

Key words Vaccinium uliginosum Linn.； Mycorrhiza； Endophytic fungi； Morphological characteristics； Molecular identification

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）屬杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）多年生落葉灌木，沒(méi)有根毛，為淺根系植物，果實(shí)為藍(lán)紫色小漿果[1，2]。研究表明，越橘果實(shí)中花青素含量是所有水果與蔬菜之最[3]，花青素具有抗氧化、抗癌和改善視力等巨大的保健價(jià)值[4]，此外，越橘還含有尼克酸、黃酮等特殊成分，因此常被譽(yù)為“漿果之王”[3]。由于具有豐富的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，越橘在我國(guó)乃至世界的栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，已成為最具發(fā)展?jié)摿Φ墓麡?shù)樹(shù)種之一[5]。目前，我國(guó)栽培的越橘品種均引自國(guó)外，國(guó)內(nèi)豐富的野生越橘資源未能得到有效的利用。東北的篤斯越橘作為我國(guó)重要且極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的野生越橘資源之一[6]，其改良和馴化均未取得理想的成果，越橘菌根共生學(xué)方面的基礎(chǔ)研究將為野生越橘資源改良和馴化提供必要的理論和實(shí)踐支撐。

在自然條件下，越橘根系與菌根真菌共生形成杜鵑類(lèi)菌根（Ericoid Mycorrhizal Fungi，EMF），又稱(chēng)歐石楠類(lèi)菌根[1]。杜鵑類(lèi)菌根真菌在緩解根系對(duì)水分及營(yíng)養(yǎng)吸收能力低、植物對(duì)逆境因子抗性能力偏弱等問(wèn)題上具有極其重要的作用[7]。在人工栽培條件下越橘根系和菌根真菌的共生需要較長(zhǎng)的時(shí)間，且侵染率極低，有研究表明人工接種有效的菌根真菌將會(huì)顯著促進(jìn)越橘的生長(zhǎng)發(fā)育[8]。因此根系真菌的分離純化這一工作將有望解決野生篤斯越橘的移栽、馴化與改良等問(wèn)題。endprint

本研究對(duì)長(zhǎng)白山地區(qū)野生篤斯越橘菌根的形態(tài)結(jié)構(gòu)和分布特征進(jìn)行初步觀察，并對(duì)其根系內(nèi)生真菌進(jìn)行了分離與鑒定，為篤斯越橘菌根生態(tài)學(xué)研究及內(nèi)生真菌資源合理開(kāi)發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料為長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根。長(zhǎng)白山自然保護(hù)區(qū)海拔1 300 m以下的篤斯越橘部分生長(zhǎng)在泥炭蘚沼澤草甸子里，部分生長(zhǎng)在苔蘚層較厚的落葉松林下。調(diào)查樣地中心點(diǎn)位于N 43°08′27″、E 127°02′16″，距圓池入口西側(cè)約9.5 km、邊防公路北約1.8 km處。取樣時(shí)輕輕去掉根系表面附著的苔蘚枯死殘留物，將健康的根連同泥土一并裝入無(wú)菌采樣袋，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行處理。

1.1.2 培養(yǎng)基 內(nèi)生真菌的分離與純化使用MEA培養(yǎng)基，保藏使用PDA培養(yǎng)基。

MEA培養(yǎng)基：麥芽浸膏3%、大豆蛋白胨0.3%、葡萄糖2.0%、瓊脂1.5%、蒸餾水定容至所配體積。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0%（煮汁過(guò)濾）、葡萄糖2.0%、瓊脂1.5%、蒸餾水定容至所配體積。

MEA培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基在滅菌之前均將pH調(diào)至5.7，121℃高壓蒸汽滅菌30 min，滅菌后待培養(yǎng)基溫度降至60℃左右，向培養(yǎng)基中加入青霉素（50 μg/mL）和鏈霉素（100 μg/mL）后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 挑取新鮮、健康的根，將根上的苔蘚、土壤清洗干凈，根據(jù)不同的試驗(yàn)選擇不同粗細(xì)的根。

1.2.2 菌根染色、形態(tài)觀察 將選取的根切成1 cm長(zhǎng)小段，用軟化酸處理后于FAA固定液中固定。采用以下方法染色觀察[9]：（1）組織透明：將根放入裝有10% KOH溶液的試管中，并將試管置于80℃恒溫水浴鍋中水浴30 min，對(duì)根樣進(jìn)行透明處理；（2）漂洗：倒掉KOH溶液，用蒸餾水沖洗3次；（3）酸化：在室溫條件下用5%雙氧水浸泡15 min，倒出雙氧水溶液，再用5%鹽酸浸泡10 min， 倒掉鹽酸溶液；（4）染色：向試管中加入適量臺(tái)盼藍(lán)溶液，同時(shí)將試管置于80℃恒溫水浴鍋中染色2 h；（5）脫色：染色完成后，取出根樣在乳酸中脫色10 min；（6）鏡檢：將脫色后的根放到滴有乳酸的載玻片上，蓋上蓋玻片進(jìn)行光學(xué)顯微觀察。

用鑷子挑取粗細(xì)均勻的根段，剪成約0.5 cm長(zhǎng)小段，共100個(gè)根段，每5個(gè)根段整齊排列于滴有乳酸的干凈載玻片上，蓋上干凈蓋玻片，用光學(xué)顯微鏡觀察，記錄菌根的菌絲形態(tài)與分布及每個(gè)根段的侵染情況。

1.2.3 侵染率計(jì)算方法 按照根段頻率標(biāo)準(zhǔn)法測(cè)定菌根侵染率[10]，即根據(jù)每段根系存在菌根結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度占根段總長(zhǎng)度的百分比（沒(méi)有菌根結(jié)構(gòu)的根段侵染率為0，整條根段都被侵染的為100%，只有一半長(zhǎng)度被侵染的為50%），按0、10%、20%、……、90%、100%的侵染程度計(jì)算根段侵染率，并記錄各種侵染率下的根段條數(shù)，然后按照下列公式計(jì)算該樣品的侵染率：

侵染率（%）=[∑（0×根段數(shù)+10%×根段數(shù)+20%×根段數(shù)+……+90%×根段數(shù)+100%×根段數(shù)）]/總根段數(shù)

1.2.4 內(nèi)生真菌的分離 將根樣分成粗和細(xì)兩種類(lèi)型，并分別轉(zhuǎn)移至兩個(gè)培養(yǎng)皿中。

根段表面消毒：（1）細(xì)根：向裝有細(xì)根的培養(yǎng)皿中倒入10%雙氧水浸泡8 min后，用無(wú)菌鑷子將根轉(zhuǎn)移至無(wú)菌培養(yǎng)皿（每次加入溶液或洗根之前都重復(fù)此操作）中，無(wú)菌水洗3遍，再倒入6%的次氯酸鈉消毒1.5 min，再用無(wú)菌水洗5遍，最后用無(wú)菌濾紙吸干，待用；（2）粗根：步驟同細(xì)根的消毒方法，僅改變消毒的時(shí)間，10%雙氧水消毒10 min， 6%次氯酸鈉消毒2 min。分別將消毒后的粗根和細(xì)根剪成0.3～0.5 cm長(zhǎng)的根段。

內(nèi)生真菌的培養(yǎng)：（1）根段直接分離培養(yǎng)：每個(gè)培養(yǎng)皿中放置4個(gè)根段，將根段用消毒過(guò)的鑷子輕壓進(jìn)培養(yǎng)基，模擬內(nèi)生真菌在土壤中的環(huán)境，有利于營(yíng)養(yǎng)的吸收。將培養(yǎng)皿置于20℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2～3周。粗根和細(xì)根分別重復(fù)25次。（2）組織研磨分離培養(yǎng)：向研缽中加入100個(gè)根段和少量無(wú)菌水，充分研磨后，用移液槍取適量研磨溶液至培養(yǎng)皿中，再向培養(yǎng)皿中倒入降溫到60℃左右的培養(yǎng)基，輕微平搖培養(yǎng)皿使研磨溶液均勻分布于培養(yǎng)基中。粗根和細(xì)根分別重復(fù)25次。

內(nèi)生真菌的純化：在無(wú)菌條件下用接種針挑取菌絲至MEA培養(yǎng)基中，每個(gè)菌落在同一平板內(nèi)點(diǎn)3個(gè)菌斑，20℃黑暗培養(yǎng)2周后看菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度等是否一致，若不一致，繼續(xù)進(jìn)行二次純化。

內(nèi)生真菌的篩選：純化完成后，將所有菌落都接種到PDA培養(yǎng)基上，一個(gè)菌落點(diǎn)1個(gè)菌斑，做3個(gè)重復(fù)，于20℃黑暗培養(yǎng)2周，若菌株都能生長(zhǎng)，則進(jìn)行形態(tài)鑒定；若出現(xiàn)部分不能生長(zhǎng)的菌株，只有一個(gè)菌株時(shí)，該菌株就作為最終分離篩選的結(jié)果，而數(shù)量較多時(shí)，就只在MEA培養(yǎng)基上進(jìn)行形態(tài)鑒定與篩選。對(duì)篩選出來(lái)的菌落特征進(jìn)行描述與記錄，主要包括菌落直徑、顏色、質(zhì)地等形態(tài)特征。記錄完成后挑取菌落邊緣菌絲，經(jīng)處理后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體、孢子、孢子梗等，進(jìn)行形態(tài)鑒定。不能明確鑒定的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定。

1.2.5 DNA的提取與序列測(cè)定 根系內(nèi)生真菌培養(yǎng)及DNA提取參考莊彩云等[11]的方法；根系內(nèi)生真菌菌株rDNA ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化參考李潞濱等[12]的方法；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送北京華大基因發(fā)展有限公司切膠純化測(cè)序。

1.2.6 內(nèi)生真菌的鑒定 真菌鑒定依據(jù)形態(tài)特征和ITS序列分析相結(jié)合的方法。菌種經(jīng)純化鑒定后，接入保藏培養(yǎng)基PDA斜面，于魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物菌種保藏室4℃冰箱中保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根著生狀態(tài)

2.1.1 菌根侵染形態(tài) 根外菌絲：在所觀察的部分野生篤斯越橘根系表面，根外的菌絲較為常見(jiàn)，比較常見(jiàn)的有兩種類(lèi)型，一種是細(xì)的菌絲，通常能密集包裹、纏繞在整個(gè)根系表面（圖1A）；另一種是較粗的有隔菌絲，比較稀疏的分布在根系表面（圖1B、C）。endprint

內(nèi)生真菌菌絲：在野生篤斯越橘根系內(nèi)觀察到了三類(lèi)不同形態(tài)的內(nèi)生真菌菌絲，在細(xì)胞間游走的菌絲（圖1F、G）、細(xì)胞內(nèi)菌絲團(tuán)（圖1D、E）和貫穿細(xì)胞的菌絲（圖1H）。在細(xì)胞間隙游走的菌絲以粗菌絲為主，菌絲都有隔，但是形態(tài)有所不同，有的較為規(guī)則地沿著細(xì)胞間隙縱向生長(zhǎng)（圖1G），有的則不規(guī)則、彎曲地貼著細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1F）；細(xì)胞內(nèi)菌絲團(tuán)同根外菌絲一樣，也有粗和細(xì)兩種菌絲體，粗菌絲形成致密菌絲團(tuán)（圖1D），會(huì)明顯撐大所侵染的細(xì)胞，在顯微鏡下菌絲膨大成泡囊狀，細(xì)菌絲則形成疏松的菌絲團(tuán)（圖1E），不會(huì)明顯影響細(xì)胞的形狀；貫穿細(xì)胞壁的菌絲較少見(jiàn)。除了以上三類(lèi)內(nèi)生真菌菌絲外還觀察到了根細(xì)胞內(nèi)正在降解的菌絲（圖1I）。

2.1.2 菌根侵染率 經(jīng)觀察與統(tǒng)計(jì)，長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根侵染率達(dá)到75%，且?guī)в懈獾母吻秩韭势毡檩^低。

2.2 內(nèi)生真菌的分離

2.2.1 不同分離方法、粗細(xì)根樣對(duì)內(nèi)生真菌分離效果的影響 內(nèi)生真菌分離試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，從粗根和細(xì)根分離的結(jié)果來(lái)看，粗根中分離得到62個(gè)菌株，細(xì)根分離得到113個(gè)菌株，細(xì)根分離到的菌株數(shù)明顯高于粗根的菌株數(shù)。從分離方法上看，根段組織直接培養(yǎng)分離法得到74株菌株，根段組織研磨培養(yǎng)分離法獲得101株菌株，根段組織研磨培養(yǎng)分離法優(yōu)于根段組織直接培養(yǎng)分離法。

2.2.2 菌株形態(tài)特征 將分離到的175株內(nèi)生真菌根據(jù)其形態(tài)特征差異分為12類(lèi)，各類(lèi)菌株形態(tài)描述如表2。

2.3 內(nèi)生真菌分類(lèi)

分離得到的175株內(nèi)生真菌，其中150株經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子綜合鑒定為5屬8種（表3）；另外25株無(wú)法命名到屬。Phialocephala spp.是優(yōu)勢(shì)屬，占菌株總數(shù)的68.57%。

3 結(jié)論與討論

3.1 長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根著生狀態(tài)

從顯微觀察結(jié)果來(lái)看，長(zhǎng)白山野生篤斯越橘菌根的菌絲形態(tài)多樣，根外菌絲與根內(nèi)菌絲的形態(tài)具有一致性，同時(shí)根外菌絲從稠密程度上明顯高于根內(nèi)菌絲，這為人工接種內(nèi)生真菌提高侵染率提供了理論依據(jù)[11]。在表皮細(xì)胞內(nèi)觀察到的粗菌絲形成致密的菌絲團(tuán)，在一定程度上改變了細(xì)胞的形狀，這種變化可以增加營(yíng)養(yǎng)吸收的面積還是會(huì)對(duì)表皮細(xì)胞造成一定的危害，尚需要進(jìn)一步試驗(yàn)求證。長(zhǎng)白山野生篤斯越橘內(nèi)生真菌的侵染率達(dá)到了75%，這對(duì)于分離多種多樣的內(nèi)生真菌提供了豐富的資源。有試驗(yàn)表明菌根真菌能侵染中柱[2]，由于本試驗(yàn)未做越橘菌根的橫切片，只對(duì)毛根處理后直接壓片，未能見(jiàn)到侵染中柱的真菌，該方面還需要進(jìn)一步研究。

3.2 內(nèi)生真菌的分離

從本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，細(xì)根不論是從分離菌株數(shù)量上，還是種類(lèi)上明顯多于粗根，其中粗根分離的菌株菌絲的顏色主要以灰黑色和白色為主，而細(xì)根則以灰黑色為主。細(xì)根與粗根本質(zhì)上是根齡不同，說(shuō)明分離出的白色菌株侵染性比較持久或者是白色菌株專(zhuān)性侵染根齡較長(zhǎng)的根系。從細(xì)根的顯微鏡觀察中看到正在降解的菌絲可以推測(cè)，造成細(xì)根分離出的菌株多于粗根的原因可能是某些種類(lèi)的內(nèi)生真菌到了一定的時(shí)間就會(huì)降解，造成根齡較長(zhǎng)的菌根分離出來(lái)菌株的數(shù)量和種類(lèi)較少。

無(wú)論從分離出菌株的數(shù)量還是種類(lèi)上，采用根段組織研磨分離法分離出來(lái)的菌株均比根段直接培養(yǎng)法分離出來(lái)的菌株多。造成數(shù)量的差異主要是因?yàn)椋心ハ喈?dāng)于把細(xì)菌根分成很小的根段，或者說(shuō)通過(guò)研磨能把在菌根內(nèi)纏在一起的菌絲最大程度地分離開(kāi)，使菌絲盡可能形成獨(dú)立的菌株，避免覆蓋，而剪成一定長(zhǎng)度的根段，由于不同種類(lèi)的內(nèi)生菌之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，相互之間容易覆蓋，一般一個(gè)小根段只能分離出一株內(nèi)生真菌，數(shù)量是有限的，所以研磨處理分離的菌株數(shù)量多；同樣的原因，造成種類(lèi)的差異，研磨能把各個(gè)種類(lèi)的真菌分離開(kāi)，減少不同真菌之間的競(jìng)爭(zhēng)，使得長(zhǎng)勢(shì)慢的真菌與長(zhǎng)勢(shì)快的真菌各自分離，所以研磨得到的種類(lèi)多。根段組織研磨分離法為分離更多的菌種資源提供了切實(shí)可行的方法。

3.3 菌株的鑒定

分離到的175株內(nèi)生真菌，根據(jù)其形態(tài)差異共分為12類(lèi)，其中150株經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子綜合鑒定為5屬8種，其中有3個(gè)種都為Phialocephala屬，有文獻(xiàn)指出，該屬是菌根中常見(jiàn)的內(nèi)生真菌[13]，形態(tài)多樣。另外，還有25株真菌無(wú)法鑒定到屬，有可能代表新真菌。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 伏洪峰， 楊秀麗， 閆偉. 大興安嶺野生越橘菌根形態(tài)學(xué)研究[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 34（2）： 165-169.

[2]苗迎秋，王賀新，李根柱， 等. 長(zhǎng)白山篤斯越橘菌根形態(tài)結(jié)構(gòu)及內(nèi)生菌的分布特征[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，44（1）： 81-85.

[3]胡雅馨， 李京， 惠伯棣. 藍(lán)莓果實(shí)中主要營(yíng)養(yǎng)及花青素成分的研究[J]. 食品科學(xué)， 2006，27（10）： 600-603.

[4]方仲相， 胡君艷， 江波， 等. 藍(lán)莓研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013，30（4）： 599-606.

[5]肖軍， 楊濤， 楊鎮(zhèn)， 等. 藍(lán)莓菌根菌的分離與回接試驗(yàn)[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012（5）： 13-16.

[6]宗長(zhǎng)玲，鄧萌，宗成文，等. 篤斯越桔研究進(jìn)展[J]. 北方園藝， 2011（12）： 173-176.

[7]張春英，戴思蘭. 杜鵑花類(lèi)菌根研究進(jìn)展[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30（3）：113-119.

[8]高麗霞， 李森， 莫愛(ài)瓊， 等. 叢枝菌根真菌接種對(duì)兔眼藍(lán)莓在華南地區(qū)生長(zhǎng)的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2012，21（8）： 1413-1417.

[9]Koske R E， Gemma J N. A modified procedure for staining roots to detect VA mycorrhizas[J]. Mycological Research， 1989，92（4）：486-505.

[10]朱毓霞， 宋杰， 肖文娟. 中江石泉單參叢枝菌根真菌鑒定[J]. 中藥與臨床， 2011（3）： 17-20.

[11]莊彩云， 李潞濱， 胡陶， 等. 適用于rDNA ITS分析的蘭屬植物菌根真菌培養(yǎng)及DNA 提取方法[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007，22（3）： 4-6.

[12]李潞濱， 胡陶， 唐征， 等. 我國(guó)部分蘭屬植物菌根真菌rDNA ITS序列分析[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2008（2）： 160-164.

[13]Heather D， Sarah H， Randolph S. Distribution and molecular characterization of the root endophyte Phialocephala fortinii along an environmental gradient in the boreal forest of Alberta[J]. Mycological Research， 2000，104（10）： 1213-1221.endprint