禽流感血凝抑制試驗中雞紅細胞吸附鴨血清非特異性凝集因子方法的建立

仇桂玲　鄧銀燕

摘 要 禽流感血凝抑制試驗中，建立雞紅細胞吸附鴨血清非特異性凝集因子方法，分別對雞紅細胞懸液與鴨血清吸附處理的取液量配比、吸附時間以及雞紅細胞濃度進行探討。在確定取液量配比、及吸附時間后，通過對同一批鴨血清樣品分別經(jīng)不同濃度的雞紅細胞懸液吸附處理后進行一系列對比試驗，找出雞紅細胞懸液吸附處理鴨血清中非特異性凝集因子的最佳濃度。對比發(fā)現(xiàn)，采用在96孔90?微孔板中逐孔加入0.05 mL待檢血清和0.05 mL20%雞紅細胞懸液吸附1 h以上能夠獲得理想效果。

關(guān)鍵詞 禽流感抗體；非特異性凝集因子；雞紅細胞吸附；鴨血清

中圖分類號：S852.5 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）15-00-02

目前，在采用雞紅細胞懸液進行血凝抑制試驗檢測鴨血清中禽流感抗體時，常常存在非特異性凝集現(xiàn)象，導(dǎo)致在結(jié)果判定時，雞紅細胞不流淌或流淌不完全，給結(jié)果判定造成嚴(yán)重干擾。鑒于實驗室的條件限制，難以采集鴨紅細胞進行同源血清抗體檢測，普遍采用雞紅細胞懸液進行檢測。禽流感血凝抑制試驗中雞紅細胞吸附鴨血清非特異性凝集因子方法的建立分別對雞紅細胞懸液與樣品血清吸附處理的取液量配比、吸附時間以及雞紅細胞濃度進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

抗原：禽流感病毒H5亞型（re-6）血凝抑制試驗抗原，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。血清：20份新鮮鴨血清。

1.2 儀器用品

96孔90?V型微孔板和BIOHIT可調(diào)移液器。

1.3 方法

1.3.1 紅細胞懸液制備

1%、5%、10%、20%雞紅細胞懸液。1%雞紅細胞懸液按GB/T18936-2003方法制備。5%、10%、20%雞紅細胞懸液分別按照0.5、1、2 mL雞紅細胞原液溶于10 mLPBS制得。雞紅細胞原液在最后一次洗滌離心后去掉上清液后制得。

1.3.2 血凝抑制試驗

按照GB/T18936-2003[1]。

1.3.3 雞紅細胞懸液與樣品血清吸附處理的取液量及配比的確定

因本法采用在微孔板中逐孔加入待檢血清和雞紅細胞懸液進行吸附，為確保吸附處理后的樣品上清液大于血凝抑制試驗檢測樣品量0.025 mL，并且不稀釋樣品致影響樣品抗體效價測定，故以1∶1配比吸附；同時，加入微孔中的液體總量不至于溢出，本法采用0.05 mL雞紅細胞吸附0.05 mL鴨血清。

1.3.4 吸附時間的確定

參考GB/T18936-2003中HA及HI試驗中抗原抗體吸附時間在30～40 min，為保證雞紅細胞對鴨血清非特異性凝集因子的最大限度的吸附及完全沉淀出上清液，本法吸附時間采用60 min。

1.3.5 用于吸附的雞紅細胞懸液濃度的研究

雞紅細胞懸液吸附預(yù)處理及分組試驗。為了尋求雞紅細胞懸液吸附處理鴨血清中非特異性凝集因子的最佳濃度，選取5%、10%、20%，30%雞紅細胞吸附預(yù)處理后進行對比試驗，以比較其檢測效價和判定效果。在微孔板中進行吸附處理，加貼膜覆蓋以防揮發(fā)，輕震后靜置1 h，吸取0.025 mL上清進行檢測。

按以下5個分組進行鴨血清禽流感H5亞型抗體效價檢測，用1%雞紅細胞懸液對20份直接測定為7log2的不同鴨血清進行血凝抑制試驗抗凝集效果統(tǒng)計。A組：直接測定；B組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 5%雞紅細胞懸液吸附后測定；C組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 10%雞紅細胞懸液吸附后測定；D組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 20%雞紅細胞懸液吸附后測定；E組：0.05 mL待檢血清+0.05 mL 30%雞紅細胞懸液吸附后測定。

2 結(jié)果

4種測定方法凝集現(xiàn)象去除效果對比見表1；5種測定方法血清效價具體結(jié)果見表2（效價單位為Log2）。

表1中，凝集數(shù)A：僅1～2孔出現(xiàn)凝集的份數(shù)；凝集數(shù)B：2孔以后出現(xiàn)凝集的份數(shù)；不凝集數(shù)：不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象的份數(shù)；凝集率B：凝集數(shù)B/30，其下降可反映去除兩孔以后非特異性凝集因子的效果[2]；去除凝集率：不凝集數(shù)/30，其上升可反映完全去除非特異性凝集因子的效果。表2中，將B、C、D方法分別和A法進行了比較，結(jié)果表明B、C、D法測得的效價與A法差異不顯著（P）。

3 討論

從表1結(jié)果來看，鴨血清經(jīng)10%、20%、30%雞紅細胞吸附處理后，非特異性凝集率（總凝集率）由A法的100%下降至C、D法的95%、75%、75%，表明雞紅細胞吸附法能明顯去除非特異性凝集因子。 經(jīng)10%、20%、30%雞紅細胞吸附處理后，2孔以后的非特異性凝集率（凝集率B）由A法的95%下降至C、D、E法的30%、25%、25%，表明.10%.20%雞紅細胞吸附在去除2孔以后的凝集現(xiàn)象效果均明顯；去除凝集率由C法5%上升到30%、25%，可見20%、30%雞紅細胞吸附處理比10%雞紅細胞吸附更能去除2孔以內(nèi)的非特異性凝集因子甚至完全去除單個樣品的凝集現(xiàn)象，從表2結(jié)果來看，鴨血清中非特異性凝集因子會使抗體效價出現(xiàn)1～2個滴度的誤差，因此有必要去除。

4 小結(jié)

試驗表明30%、20%、10%雞紅細胞懸液吸附處理比5%雞紅細胞懸液吸附處理，更明顯降低血清中非特異凝集的影響，10%及以上濃度雞紅細胞懸液即可對鴨血清中非特異性凝集因子明顯去除，20%、30%雞紅細胞懸液吸附在去除非特異性凝集上整體效果相當(dāng)。出于便于雞紅細胞懸液制備的考慮，采用較低雞紅細胞濃度，即20%雞紅細胞懸液應(yīng)用于日常檢測進行對鴨血清廢特異性凝集因子的去除。

參考文獻

[1]GB/T18936-2003，高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[2]鄧波，李凱航，薛霞，等.禽流感血凝抑制試驗中鴨血清非特異性凝集因子去除方法的研究[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2010，31（7）：39-41.

（責(zé)任編輯：劉昀）