紫山藥色素醇提物的抗氧化活性研究

霍艷榮　高前欣　王振宇

摘要[目的] 采用體外試驗(yàn)的方法測(cè)定紫山藥色素清除自由基的抗氧化性功能。[方法] 以乙醇為溶劑提取紫山藥色素，AB-8大孔樹脂制備純化物，采用清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH法、測(cè)定還原力等體外試驗(yàn)方法研究其對(duì)自由基體系的抗氧化作用、還原力大小。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，紫山藥色素具有良好的抗氧化能力，純化后抗氧化能力增強(qiáng)。純化后清除羥自由基的IC50略低于VC，當(dāng)純化物濃度高于0.7 mg/ml時(shí)，其清除率高于VC；當(dāng)純化物濃度達(dá)到5.0 mg/ml時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為95%，高于VC（92%）；濃度高于2.0 mg/ml時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率與VC相當(dāng)。[結(jié)論]研究可為拓展紫山藥色素的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)，為天然抗氧化劑的開發(fā)人員和食品行業(yè)的技術(shù)人員提供新的參考資料。

關(guān)鍵詞紫山藥色素；醇提物；自由基；抗氧化

中圖分類號(hào)S632.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-299-03

Study on Antioxidant Activity of Ethanol Extracts from Purple Yam Pigment

HUO Yan-rong1，2， GAO Qian-xin2， WANG Zhen-yu1，3*

（1. Forestry College， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040； 2. Zhejiang Agricultural and Forest University， Hangzhou， Zhejiang 311300； 3.Harbin Institute of Technology， Harbin， Heilongjiang 150090）

Abstract[Objective] The function of antioxidation and scavenging free radicals of purple yam pigment was determined by using in vitro methods. [Method] Ethanol was used to extract purple yam pigment and then purified with AB-8. Hydroxyl radicals， oxygen free radicals， DPPH radicals eliminate and reducing capacity was studied by in vitro methods. [Result] The results showed that purple yam pigment has good antioxidant ability and enhanced after purification. IC50 of ·OH was slightly lower than VC and higher than it when the concentration was more than 0.7 mg/ml. The oxygen free radicals eliminate ratio was 95%， higher than VC（92%） when it was 5.0 mg/ml. The DPPH· eliminate ratio was same as VC when the concentration higher than 2.0 mg/ml. [Conclusion] The study can provide theoretical basis for expanding application field of purple yam pigment， and provide reference data for natural antioxidants developers and technical personnel of food industry.

Key wordsPurple yam pigment； Alcohol extracts； Free radicals； Antioxidant

紫山藥也稱“紫人參”，又名薯蕷和長(zhǎng)芋，屬薯蕷科，以其肥大的塊根或圓柱狀根供食用。紫山藥富含薯蕷皂苷元，特別是它含有8種酚類黃酮物質(zhì)的花色苷[1]。

花色苷是漿果和花朵中所看到的紅色到藍(lán)色的色素。人們對(duì)于花色苷在功能食品中的應(yīng)用興趣越來(lái)越濃，保健食品工業(yè)最近報(bào)道了花色苷的很多潛在的對(duì)健康的益處[2]，包括對(duì)冠心病，改善視覺和抗癌性，抗突變和抗炎癥的效果[3-5]。

筆者采用體外試驗(yàn)的方法測(cè)定紫山藥色素清除自由基的抗氧化性功能，為紫山藥色素開辟了廣闊的應(yīng)用空間，為拓展紫山藥色素的應(yīng)用領(lǐng)域提供了理論依據(jù)，為天然抗氧化劑的開發(fā)人員和食品行業(yè)的技術(shù)人員提供新的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

供試原料。新鮮紫山藥，從市場(chǎng)上購(gòu)買。

1.1.2

主要試劑。硫酸亞鐵，水楊酸-乙醇，雙氧水，抗壞血酸，PBS，Na2HPO4，KH2PO4，TCA，F(xiàn)eCl3，K3Fe（CN）6，DPPH，Tris-HCl，鄰苯三酚，石油醚，無(wú)水乙醇，檸檬酸，濃鹽酸，AB-8大孔吸附樹脂。

1.1.3

主要儀器設(shè)備。

752PC型紫外可見分光光度計(jì)，SSW型微電腦電熱恒溫水槽，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，予華牌循環(huán)水真空泵，臺(tái)式離心機(jī)，電子天平，臺(tái)式恒溫振蕩器，立式振蕩培養(yǎng)箱。

1.2方法

1.2.1

紫山藥的選取、購(gòu)買。在紫山藥成熟季節(jié)，選擇品質(zhì)較好、性狀均一、無(wú)破損腐爛的新鮮紫山藥。

1.2.2

紫山藥的預(yù)處理。

將購(gòu)買的紫山藥洗凈，去皮，切片，1%檸檬酸浸泡，烘干，粉碎，密封避光保存。

1.2.3

紫山藥色素的制備。

稱取一定樣品用60%的乙醇溶液按1∶20 g/ml的比例混合均勻，調(diào)溶液pH至2，60 ℃浸提1 h，3 600 r/min離心15 min，將沉淀物按同樣的條件重復(fù)浸提2次，離心，合并3次上清液，于50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮。濃縮提取液于烘箱內(nèi)干燥成浸膏狀，冷藏備用。

1.2.4

紫山藥色素粗提液的純化。

1.2.4.1

預(yù)處理 。 將AB-8大孔樹脂置于乙醇中浸泡24 h，充分溶脹后用蒸餾水充分洗滌，沖洗至無(wú)白色渾濁物出現(xiàn)后用5%鹽酸浸泡8 h，用蒸餾水充分洗滌至中性，再用5%氫氧化鈉溶液浸泡8 h，用蒸餾水充分洗滌至中性后備用。

1.2.4.2

大孔樹脂對(duì)色素的吸附及解析。

分別稱取1 g活化后的樹脂置于三角瓶中，加入同體積的紫山藥粗提液，25 ℃、110 r/min下振蕩1 h至樹脂吸附飽和。濾出水分，用pH為2、60%的乙醇，30 ℃、110 r/min下振蕩1 h，抽濾，合并解析液，50 ℃濃縮至黏稠狀，干燥得深紅色粉末備用。

1.2.5

紫山藥色素對(duì)羥自由基清除能力的研究。

在0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml待測(cè)物（粗提物樣品及純化物）1 ml中，分別加入9 mmol/L FeSO4 1 ml、9 mmol/L的水楊酸-乙醇1 ml、再加入8.8 mmol/L的 H2O2 1 ml，放入37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h。以雙蒸水作為參比，空白對(duì)照組以蒸餾水代替樣品，對(duì)照組以抗壞血酸代替樣品，分別做3次平行試驗(yàn)。在510 nm處測(cè)定吸光度，取其平均值，按下列公式計(jì)算清除率[6]：

羥基自由基的清除率（%）=（A0-A1）/A0×100

式中，A0為空白的平均吸光度；A1為樣品的平均吸光度。

1.2.6

紫山藥色素對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的研究。

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖溶液4.5 ml，置于25 ℃水浴中預(yù)熱20 min，分別加入1 ml 0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml待測(cè)物（粗提物樣品及純化物）和 0.5 ml 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min，再加入8 mol/L HCl溶液1 ml終止反應(yīng)。以Tris-HCl緩沖溶液作為參比，空白對(duì)照組以蒸餾水代替樣品，以抗壞血酸為對(duì)照，3次重復(fù)。在425 nm處測(cè)定吸光度，取其平均值，按下式計(jì)算清除率[6]：

超氧陰離子自由基清除率（%）=（A0-A1）/A0×100

式中，A0為空白的平均吸光度；A1為樣品的平均吸光度。

在其他條件都不變的情況下將純化物也同樣進(jìn)行超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定。

1.2.7

DPPH·清除能力的測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取DPPH·20 mg，用95%乙醇溶解并定容于500 ml容量瓶中，則DPPH·試劑的質(zhì)量濃度為0.04 mg/ml，避光保存。在0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml待測(cè)物（粗提物樣品及純化物）2 ml中加入2 ml DPPH·溶液充分混合?？瞻讓?duì)照組以95%乙醇代替樣品，對(duì)照組以不同濃度抗壞血酸代替樣品，分別做3次平行試驗(yàn)。30 min后在517 nm測(cè)定其吸光度[7]。各待測(cè)物對(duì)DPPH·的清除率K可用下式計(jì)算：

K=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中，Ai為2 ml DPPH溶液+2 ml待測(cè)溶液吸光度；Aj為2 ml待測(cè)溶液+2 ml溶劑的吸光度；A0為2 ml DPPH溶液+2 ml溶劑的吸光度。

1.2.8

還原力的測(cè)定。

普魯士蘭法測(cè)定還原力[8]：分別取0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/ml的待測(cè)物（粗提物樣品及純化物）2.5 ml和0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mg/ml的VC溶液2.5 ml，依次加入2.5 ml 0.5 mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH=6.6）和2.5 ml 1%六氰合鐵酸鉀溶液[K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴20 min，后快速冷卻，再加入2.5 ml 10%三氯乙酸溶液（TCA），以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液2.5 ml，依次加入2.5 ml蒸餾水，0.5 ml 0.1%三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min后，在700 nm下測(cè)定其吸光度值，以蒸餾水作參比溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1紫山藥色素粗提物、純化物對(duì)羥自由基的清除能力分析

該研究采用水楊酸法測(cè)定紫山藥色素粗提物以及純化物對(duì)羥自由基的清除作用。不同濃度紫山藥色素粗提物及純化物對(duì)羥自由基的清除作用見圖1。

圖1紫山藥色素粗提物、純化物對(duì)羥自由基的清除作用

由圖1可見，紫山藥色素純化物、粗提物對(duì)羥自由基的清除率隨其濃度的增加而增大，且具有明顯的量效關(guān)系。紫山藥色素粗提物和純化物濃度較低時(shí)，對(duì)羥自由基的清除作用較弱，當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/ml時(shí)其清除率升高，粗提物為46%，純化物為53%，VC為56%。進(jìn)一步比較純化物與VC溶液的IC50表明：紫山藥純化物清除羥自由基的IC50略低于VC，當(dāng)純化物濃度高于0.7 mg/ml時(shí)，其清除率高于VC。

2.2紫山藥色素粗提物和純化物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力分析

不同濃度紫山藥色素粗提物以及純化物、VC溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用見圖2。由圖2可見，紫山藥色素純化物、粗提物、VC溶液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨其濃度的增加而增大，且具有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)濃度較低時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用較弱；當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mg/ml時(shí)其清除率升高，粗提物為50%，純化物為48%；當(dāng)濃度為1.0 mg/ml時(shí)，純化物的清除率（75%）高于粗提物（70%）；濃度達(dá)到5.0 mg/ml時(shí)，純化物的對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為95%高于VC（92%）。

圖2紫山藥色素粗提物、純化物對(duì)超氧自由基的清除作用

2.3紫山藥色素粗提物和純化物對(duì)DPPH·清除能力分析

濃度為0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/ml的紫山藥色素粗提物及純化物溶液對(duì)DPPH·的清除作用結(jié)果見圖3。由圖3可見，紫山藥色素對(duì)DPPH·具有較好的清除作用，純化物的清除率高于粗提物，當(dāng)純化物濃度高于2.0 mg/ml時(shí)，純化物的清除率與VC相當(dāng)。

2.4紫山藥色素粗提物和純化物還原力能力分析

圖4的結(jié)果表明，紫山藥粗提取物、純化物的還原力隨濃度的增大而增大，二者呈較好的量效關(guān)系且存在顯著的線性關(guān)系。純化物的吸光度大于粗提物的吸光度，其還原能力大于粗提物的還原力，在濃度大于0.5 mg/ml時(shí)，純化物的還原力高于VC，并隨著濃度增加而增大。

圖3紫山藥色素粗提物、純化物對(duì)DPPH·的清除作用

圖4紫山藥色素粗提物、純化物還原能力

3 結(jié)論

紫山藥色素對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH·都

有較好的清除效果，并具有一定的還原力。粗提物經(jīng)純化后抗氧化效果顯著提高，純化后清除羥自由基的IC50略低于VC，當(dāng)純化物濃度高于0.7 mg/ml時(shí)，其清除率高于VC。當(dāng)純化物濃度達(dá)

到5.0 mg/ml時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率為95%，高于VC（92%）；濃度高于2.0 mg/ml時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率與VC相當(dāng)。

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