大黃魚在感染刺激隱核蟲后MHCIIB基因的表達(dá)

陳健　張東玲　葉坤等

摘要[目的] 為進(jìn)一步研究大黃魚抗刺激隱核蟲的免疫防御奠定基礎(chǔ)，也為海水魚類養(yǎng)殖的免疫預(yù)防提供參考。[方法] 用孵化2 h內(nèi)的刺激隱核蟲感染大黃魚，并運(yùn)用Real-time PCR檢測(cè)MHC IIB基因在各組織（鰓、皮膚、脾和頭腎）中表達(dá)量的變化。[結(jié)果] MHC IIB基因在鰓、皮膚和脾臟中的表達(dá)水平呈現(xiàn)先上調(diào)后逐漸下降的趨勢(shì)，在感染6和12 h后表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；在頭腎中，MHC IIB基因在感染后6 和12 h的表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），在感染2 d后顯著上升（P<0.05）。[結(jié)論] 大黃魚MHC IIB基因在刺激隱核蟲的免疫應(yīng)答過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞大黃魚；MHC IIB；刺激隱核蟲

中圖分類號(hào)S965.322文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2015）07-143-04

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）是目前已知存在于所有脊椎動(dòng)物體內(nèi)與機(jī)體免疫機(jī)能密切相關(guān)的基因群[1-2]。最常見的MHC主要由2類分子組成：MHC I和MHC II類。MHC I類分子負(fù)責(zé)將內(nèi)源性抗原呈遞給CD8+ T細(xì)胞，MHC II類分子則將外源性抗原呈遞給CD4+細(xì)胞[3-4]。MHC II類分子由α鏈和β鏈組成，其中MHC IIB基因編碼β鏈區(qū)域，是研究最為廣泛的一類MHC II分子[5-6]。近年來(lái)，已有多種魚類的MHC IIB基因被克隆和鑒定，如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[7-9]、真鯛（Pagrus major）[10]、鮸魚（Miichthys miiuy）[11]、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[12]、大菱鲆（Turbot）[13]、草魚（Grass carp）[14]、建鋰[15]（Cyprinus carpio var.jian）、鯉魚（Carp）[16-17]和斑馬魚（Zebrafish）[18-21]等，這些研究表明了MHC IIB基因的多態(tài)性和基因拷貝數(shù)目的差異性。MHC IIB基因或蛋白的組織分布和表達(dá)情況也有研究，在真鯛中MHC IIB基因在注射鰻弧菌后在肝、脾、頭腎和腸中的表達(dá)5～72 h明顯下降，96 h恢復(fù)[22]；在大菱鲆中MHC IIB基因在注射鰻弧菌后在肝和頭腎中的表達(dá)24～48 h呈下降趨勢(shì)，在脾中24～72 h顯著下降，96 h后在3個(gè)組織中的表達(dá)均上升[23]。前期的研究表明 MHC IIB基因參與由病毒和細(xì)菌所引起的魚類免疫應(yīng)答，但對(duì)其是否參與魚類抗寄生蟲的免疫應(yīng)答少有報(bào)道。

大黃魚（Larimichthys crocea）是我國(guó)主要養(yǎng)殖海水魚類之一。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖密度過(guò)大和養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因，導(dǎo)致疾病頻頻暴發(fā)，嚴(yán)重威脅產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。寄生蟲病害以刺激隱核蟲病引起的“白點(diǎn)病”最為嚴(yán)重，每年造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)于小水體養(yǎng)殖的刺激隱核蟲病，目前主要采取化學(xué)藥物治療[24]。對(duì)于網(wǎng)箱等開放養(yǎng)殖環(huán)境，一些物理方法和化學(xué)方法均起到一定效果，但它們都或多或少存在一些缺陷，如對(duì)魚有毒性、污染環(huán)境、效果不確定以及不適用于大水體等[25-26]。因此，有必要尋找一種切實(shí)可行、有效的防治方法。由于免疫預(yù)防的安全性、低成本和環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，免疫防治刺激隱核蟲病目前被認(rèn)為是一種相對(duì)有效的方法。筆者對(duì)感染刺激隱核蟲后MHC IIB基因在各組織（鰓、皮膚、脾、頭腎）中表達(dá)量的變化進(jìn)行研究，探討MHC IIB基因在宿主對(duì)刺激隱核蟲免疫應(yīng)答中發(fā)揮的作用，從分子角度初步揭示大黃魚抗寄生蟲的分子機(jī)制，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究大黃魚抗刺激隱核蟲的免疫防御奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為海水魚類養(yǎng)殖的免疫預(yù)防提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1

試驗(yàn)材料。大黃魚：健康的大黃魚采自福建寧德養(yǎng)殖海區(qū)，體重（130 ±15） g；

刺激隱核蟲：以大黃魚為宿主，寧德海水試驗(yàn)場(chǎng)傳代培養(yǎng)獲得幼蟲。

1.1.2

主要試劑。Trizol、RNA保存液（RNAfixer）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega GoscriptTM Reverse Transcription System）、熒光定量試劑盒（SuperReal PreMix Plus）等。

1.2方法

1.2.1

刺激隱核蟲感染大黃魚。分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組60條魚。試驗(yàn)前將每組大黃魚在室內(nèi)水泥池內(nèi)馴養(yǎng)10 d，鹽度25‰～26‰。溫度25 ℃。室內(nèi)馴養(yǎng)后，試驗(yàn)組用剛孵化2 h內(nèi)的刺激隱核蟲感染大黃魚，感染劑量為25 000幼蟲/尾[27]。由于刺激隱核蟲滋養(yǎng)體感染魚體后脫落，在池底形成包囊，3 d后孵化出幼蟲。為了避免重復(fù)感染，感染刺激隱核蟲的大黃魚3 d后移入新池。對(duì)照組除不給予刺激隱核蟲感染外，其他試驗(yàn)方法均與試驗(yàn)組一致。試驗(yàn)組和對(duì)照組分別在首次感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d和5 d采集大黃魚皮膚、鰓、脾臟和頭腎（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取5尾魚）。

1.2.2

大黃魚組織總RNA的提取及cDNA鏈的合成。

采用Trizol分別提取大黃魚鰓、皮膚、脾臟和頭腎4個(gè)組織的總RNA，DNase I處理殘留 DNA 后，根據(jù)Promega GoscriptTM Reverse Transcription System說(shuō)明書合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系：RNA樣品4 μg，Oligo（dT）15 Primer 1 μl，Random Primer 1 μl，Nuclease-Free Water補(bǔ)至10 μl體系，70 ℃變性5 min，冰上放置5 min；再加入Nuclease-Free Water 1.5 μl，Goscript 5×Reaction Buffer 4 μl，MgCl2 2 μl，PCR Nucleotide Mix 1 μl，Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl，Goscript Reverse Transcriptase 1 μl，共10 μl體系。混勻后，25 ℃ 5 min，42 ℃ 1 h，70 ℃ 15 min。合成后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3

大黃魚MHC IIB組織表達(dá)分析。根據(jù)大黃魚MHC IIB序列，設(shè)計(jì)特異引物（表1），以β-actin作為內(nèi)參基因，通過(guò)RT-PCR分析大黃魚MHC II基因的表達(dá)模式。利用 LightCycler 480 熒光定量?jī)x（Roche Sweden）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10.0 μl，引物F/R（10 μmol/L）0.6 μl，cDNA模板 8.4 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。利用Fold=2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，然后用試驗(yàn)組數(shù)值除以對(duì)照組數(shù)值得到試驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量，使用 SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件的 Duncans 檢驗(yàn)法分析各組數(shù)據(jù)差異的顯著性。

表1所用引物序列

引物序列（5′ -3′） 目的

MHCII B QFCTGGCAGACGCTGATTGGTmRNA表達(dá)

MHCII B QRTCTCTCAGACTCAGGCAGGGAC

β-actin-FTTATGAAGGCTATGCCCTGCCmRNA表達(dá)

β-actin-RTGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT

2 結(jié)果與分析

2.1熒光定量引物的特異性檢測(cè)

為了檢驗(yàn)引物的特異性，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增MHC IIB基因片段，PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與預(yù)期目的基因片段（150 bp）大小一致（圖1），測(cè)序結(jié)果證實(shí)序列正確，說(shuō)明設(shè)計(jì)合成的引物合格。

注：M. Marker 2000；1. MHC目的片段。

圖1 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)MHC IIB熒光定量引物特異性

試驗(yàn)組與對(duì)照組共8組不同檢測(cè)體系，以各自cDNA為模板，經(jīng)過(guò)qRT-PCR檢測(cè)后得到擴(kuò)增曲線（圖2a）和熔解曲線（圖2b）。分析發(fā)現(xiàn)，所得曲線均為單一峰，無(wú)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體產(chǎn)生，說(shuō)明設(shè)計(jì)合成的引物特異性良好。

2.2刺激隱核蟲感染大黃魚誘導(dǎo)MHC IIB的表達(dá)分析

大黃魚受刺激隱核蟲感染后，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)大黃魚MHC IIB基因在4種組織（鰓、皮膚、脾和頭腎）中的表達(dá)水平。從圖3可以看出，在鰓組織中，受刺激隱核蟲感染后，試驗(yàn)組大黃魚MHC IIB表達(dá)量在6和12 h顯著上升（P<0.05），分別為對(duì)照組的3.09倍和3.19倍。皮膚在感染12 h后MHC IIB基因的表達(dá)量顯著上升（P<0.05），其表達(dá)量為對(duì)照組的6.12倍；在感染3 d后MHC IIB基因的表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），其表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的10.1%。

在脾臟，試驗(yàn)組大黃魚MHC IIB基因的表達(dá)量在6和12 h顯著上升（P<0.05），分別為對(duì)照組的3.82倍和4.89倍，此后逐步恢復(fù)到對(duì)照組水平。頭腎在受刺激隱核蟲感染后，表達(dá)量開始下降，在6和12 h MHC IIB基因的表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），分別為對(duì)照組的61.9%和66.0%，感染2 d后MHC IIB基因的表達(dá)量顯著上升（P<0.05），其表達(dá)量為對(duì)照組的5.21倍。

3 討論

大黃魚鰓和皮膚是刺激隱核蟲感染的主要器官，也是魚類免疫防御的第一道屏障，而脾臟和頭腎是大黃魚重要的免疫器官[28]，因此選擇這4個(gè)部位來(lái)研究大黃魚在受刺激隱核蟲感染后MHC IIB基因的表達(dá)變化。在皮膚和鰓，在感染初期（6 h或12 h）MHC IIB的表達(dá)量顯著升高，12 h表達(dá)量差異達(dá)到最大值。這與斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）被刺激隱核蟲感染后， CD8 β、IL-1 β、C型凝集素和transferrin mRNA在皮膚和鰓表達(dá)水平上升的結(jié)果一致[29]。皮膚和鰓是魚體粘膜組織，它們也是與水體病原直接接觸的部位，與水體寄生蟲最先接觸，受感染后的炎癥部位也最為明顯。皮膚表皮上有粘液細(xì)胞和囊狀細(xì)胞的分布，鰓組織的細(xì)胞中分布有大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞等[30]。粘膜組織具有參與機(jī)體免疫應(yīng)答的細(xì)胞基礎(chǔ)，能夠抵御寄生蟲感染和引起相關(guān)免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前，許多學(xué)者認(rèn)為粘膜免疫系統(tǒng)可以不依賴系統(tǒng)免疫而獨(dú)立完成抗原識(shí)別、結(jié)合和呈遞，因此局部的免疫應(yīng)答對(duì)抵御病原的入侵起著重要的作用[5]。

粘膜組織（皮膚和鰓）不僅僅

是物理屏障，其局部的免疫應(yīng)答對(duì)病原體的抵御也相當(dāng)重

要。MHC IIB是生物體抵抗病原體侵染的免疫基因，在魚類的粘膜免疫抗原呈遞中發(fā)揮著重要作用。

注：a.擴(kuò)增曲線；b.熔解曲線。

圖2 MHC IIB基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

注：a.鰓；b.皮膚；c.脾；d.頭腎。*表示顯著上升；§表示顯著下降。

圖3刺激隱核蟲感染大黃魚后MHC IIB基因在鰓、皮膚、脾臟和腎臟的表達(dá)分析

刺激隱核蟲感染大黃魚鰓和皮膚后，引起局部免疫應(yīng)答，抗原向脾臟和頭腎轉(zhuǎn)移[28]。脾臟接收抗原刺激后，MHC IIB的表達(dá)量也顯著上升，產(chǎn)生免疫應(yīng)答以抵御病原入侵。脾臟是魚類紅細(xì)胞與中性粒細(xì)胞產(chǎn)生、貯存和成熟的主要場(chǎng)所，頭腎可以產(chǎn)生紅細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等，相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的骨髓。頭腎受感染后MHC IIB的表達(dá)量顯著下降，直至感染2 d后表達(dá)量才顯著回升。Xu TJ等研究發(fā)現(xiàn)半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）注射鰻弧菌后。MHC IIB基因在脾組織中的表達(dá)量變化不大，在肝組織中24 h后的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，但在96 h后表達(dá)量達(dá)到最高[11-12]，此趨勢(shì)與頭腎中MHC IIB的表達(dá)趨勢(shì)相一致。頭腎位于頭胸腔下側(cè)，緊貼脊椎，應(yīng)答抗原刺激較緩慢，到受病原感染后期才產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答反應(yīng)。這表明MHC IIB基因的表達(dá)與組織所含有的淋巴細(xì)胞有較密切的關(guān)系，從而表現(xiàn)免疫器官有較強(qiáng)的基因表達(dá)，而在鰓、皮膚等部位的表達(dá)主要是因?yàn)檫@些器官是魚類最易接觸病原體的部位。據(jù)此推斷， MHC IIB基因在魚類刺激隱核蟲免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。

[19] ONO H，KLEIN D，VINCEK V，et al. Major histocompatibility complex class Ⅱgenes of zebra-fish[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1992，89（24）：11886-11890.

[20] S？LTMANN H，MAYER W，F(xiàn)IGUEROA F，et al. Organization of Mhc class ⅡB genes in the zebra-fish （Brachydanio rerio）[J]. Genomics，1994，23：1-14.

[21] S？LTMANN H，F(xiàn)IGUEROA F，O'HUIGIN C，et al. Zebrafish Mhc class Ⅱ alpha chain-encoding genes： polymorphism，expression，and function[J]. Immuno- genetics，1993，38（6）：408-420.

[22] CHEN SL，ZHANG YX，XU MY，et al. Molecular polymorphism and expression analysis of MHC class Ⅱ B gene from red sea bream （Chrysophrys ma- jor）[J]. Dev Comp Immunol，2006，30（4）：407-418.

[23] ZHANG YX，CHEN SL. Molecular identification，polymorphism，and expression analysis of mjor histocompatibility complex class ⅡA and B genes of

turbot （Scophthalmus maximus）[J]. Marine Biotechnology（NY），2006，8：611-623.

[24] 邱軍強(qiáng)，劉瑋，楊先樂(lè)，等. 刺激隱核蟲免疫學(xué)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)志，2011，6（10）：787-797.

[25] 徐潤(rùn)林，白慶笙，李貴生，等. 刺激隱核蟲感染幼蟲的超微結(jié)構(gòu)研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)論叢，1995（1）：142-145.

[26] 劉振勇，林小金，謝友佺，等. 大黃魚刺激隱核蟲病繼發(fā)細(xì)菌感染致死原因的研究[J]. 福建水產(chǎn)，2010（1）：47-48.

[27] 鐘正蘋，但學(xué)明，李安興，等. 斜帶石斑魚CD4基因克隆和組織表達(dá)分析[J]. 四川動(dòng)物，2008，30（6）：875-881.

[28] 劉云，姜國(guó)良，姜 明，等. 牙鲆鰓淋巴樣組織內(nèi)免疫相關(guān)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，31（6）：872-876.

[29] LI YW，DAN XM，ZHANG TW，et al. Immune-related genes expression profile in orange- spotted grouper during exposure to Cryptocaryon irritans[J].

Parasite Immunol，2011，33： 679- 687.

[30] FAST MD，SIMS DE，BURKA JF，et al. Skin morphology and humoral non-specific defence parameters of mucus and plasma in rainbow trout，coho and

Atlantic salmon[J]. Comp Biochem Physiol，2002，132： 645-657.