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      RP—HPLC法同時測定六味地黃膠囊中3種成分含量

      2015-07-13 05:21:42楊堃鄭小平阮陶仁
      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年15期
      關(guān)鍵詞:芍藥苷

      楊堃 鄭小平 阮陶仁

      摘要 [目的]建立同時測定六味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚3種成分含量的反相高效液相色譜法(RPHPLC)。[方法]以Waters ODS C18( 4.6 mm×250 mm,5 μm)柱為分析柱、甲醇-0.1%磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.0 ml/min,檢測波長芍藥苷和馬錢苷為230 nm、丹皮酚為274 nm,柱溫40 ℃。[結(jié)果]芍藥苷在0.066 5~1.663 2 μg、馬錢苷在0.107 9~2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4~3.060 0 μg范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 4、0.999 8、0.999 9,平均回收率為芍藥苷97.63%(RSD=0.82%)、馬錢苷97.66%(RSD=0.74%)、丹皮酚96.22%(RSD=1.21%)。[結(jié)論]該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好,可用于六味地黃膠囊的質(zhì)量控制。

      關(guān)鍵詞 六味地黃膠囊;芍藥苷;馬錢苷;丹皮酚;RPHPLC

      中圖分類號 S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611(2015)15-074-04

      Simultaneous Determination of Three Constituents in Liuwei Dihuang Capusule by RPHPLC

      YANG Kun1, ZHENG Xiaoping1, RUAN Taoren2*

      (1. Chongqing Food and Drug Control Institute, Chongqing 401121; 2. Chongqing City Hospital of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 401121)

      Abstract [Objective] To establish RPHPLC method for simultaneous determining paeoniflorin, loganin and paeonol in Liuwei Dihuang Capsule. [Method] RPHPLC assay was carried out using a Waters ODS C18 (4.6 ×250 ,5 ) column.The mobile phase was consisted of methanol -0.1% phosphoric acid in gradient elution.The flow rate was 1.0 ml/min.The UV detection wavelength was set at 230 for paeoniflorin and loganin,and 274 for paeonol.The column temperature was 40 ℃. [Result] The linear ranges of paeoniflorin, loganin and paeonol were 0066 5-1.663 2 (r=0.999 4 ), 0.107 9-2.697 7 (r=0.9998 ), 0.122 4-3.060 0 (r=0.999 9 ), respectively. The average recoveries of paeoniflorin, loganin and paeonol were 97.63% (RSD was 0.82%) , 97.66% (RSD was 0.74%) , and 96.22% (RSD was 121%) , respectively. [Conclusion] The method is simple, accurate and reproducible. It can be used for the quality control of Liuwei Dihuang Capsule.

      Key words Liuwei Dihuang Capsule; Paeoniflorin; Loganin; Paeonol; RPHPLC

      六味地黃膠囊是由滋陰補(bǔ)腎的經(jīng)典代表方劑六味地黃丸改進(jìn)制劑方法而成的,是《中國藥典》2010版一部收載的常用復(fù)方制劑。六味地黃膠囊依然由熟地黃、酒萸肉、山藥、牡丹皮、茯苓和澤瀉六味中藥組成,只是改進(jìn)了制備方法,減少了服用量,易于保存和增加病人的依從性。所以六味地黃膠囊同樣具有滋陰補(bǔ)腎的功效,可用于腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精的治療[1]。喻箴等通過臨床研究表明六味地黃膠囊總療效明顯優(yōu)于傳統(tǒng)劑型六味地黃丸[2];韋詠蓮也通過臨床研究發(fā)現(xiàn)六味地黃膠囊治療2型糖尿病有助于控制血糖,減輕病情[3]。

      2010版《中國藥典》記載采用高效液相色譜法測定六味地黃膠囊中丹皮酚的含量,用薄層掃描法測定熊果酸的含量[1];遲富杰等采用HPLC法測定六味地黃膠囊中熊果酸含量[4-5]和丹皮酚的含量[6-7];水彩紅等采用HPLC法測定六味地黃膠囊中馬錢苷的含量[8-9]和芍藥苷的含量[10]。這些方法均是對單一成分的檢查,而六味地黃膠囊中成分多,為提高其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),筆者參考和改進(jìn)了李向陽等對于六味地黃丸采用HPLC法進(jìn)行含量測定的方法[11-12],從而建立了同時測定六味地黃膠囊中芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚3種成分的HPLC方法,為提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、全面評價其內(nèi)在質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 儀器 美國Waters2695型高效液相色譜儀;KQ500B型超聲波提取器(昆山市超聲儀器有限公司);BP221S萬分之一分析天平(德國Sartorius);AX205十萬分之一分析天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

      1.2 試藥 六味地黃膠囊(吉林省撫松制藥股份有限公司 0.3 g×24粒);芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定所,定量測定用,批號110736-201136);馬錢苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,定量測定用,批號110640-201005);丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所,定量測定用,批號110708-200505);甲醇為色譜純;水為純化水,其余試劑均為分析純。

      1.3 方法

      1.3.1 溶液的配置。

      1.3.1.1 對照品溶液的制備。取芍藥苷和馬錢苷對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml分別含芍藥苷66.528 0 μg、馬錢苷107.906 5 μg的混合溶液,即得。取丹皮酚對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml含丹皮酚122.4 μg的溶液,即得。

      1.3.1.2 供試品溶液的制備。取同一批次樣品(批號120202 85),取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 ml,稱定重量,超聲處理(500 W,40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻,濾過,續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。

      1.3.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。色譜柱為Waters ODS C18( 4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫40 ℃;流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng),梯度洗脫,梯度洗脫程序如表1所示;體積流量1.0 ml/min;進(jìn)樣量10 μl ;檢測波長芍藥苷和馬錢苷為230 nm、丹皮酚為274 nm。

      1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取“1.3.1.1”項下的2種對照品溶液1、5、10、15、20、25 μl,分別注入液相色譜儀,測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積,以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.4 精密度試驗。精密吸取“1.3.1.1”項下的2種對照品溶液,分別連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣體積為10 μl,測定馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積,分別計算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

      1.3.5 穩(wěn)定性試驗。取“1.3.1.2”項下同一供試品溶液,分別于0、3、6、9、12、15 h注入液相色譜儀,進(jìn)樣體積為10 μl,測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積,分別計算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD。

      1.3.6 重復(fù)性試驗。取同一批次樣品(批號120202 85),按“1.3.1.2”方法平行制備6份供試品溶液,分別測得芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量,并分別計算芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD。

      1.3.7 加樣回收率試驗。取已測定的六味地黃膠囊樣品(芍藥苷0.377 0 mg/粒、馬錢苷0.603 0 mg/粒、丹皮酚3.990 4 mg/粒),取約0.25 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,分別精密加入含芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚對照品的混合甲醇溶液(芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的濃度分別為0.013 3、0.021 6、0.135 6 mg/ml)25 ml,以下按“1.3.1.2”項下制備方法操作,平行操作,制得6份加樣供試品溶液。吸取加樣供試品溶液10 μl,注入液相色譜儀,測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚,計算加樣回收率和RSD。

      1.3.8 樣品含量測定。按“1.3.1.2”項下方法制備供試品溶液,測定3個廠家六味地黃膠囊中芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚,平行測定3次,計算含量和RSD。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 從圖1可看出,該方法所得對照品色譜峰峰形尖銳,對稱性好;供試品中的芍藥苷和馬錢苷色譜峰對稱性好,與前后其他峰分離度>1.5,可見芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚色譜峰與相鄰成分可達(dá)基線分離,且陰性試驗無干擾,理論板數(shù)按芍藥苷峰計算不低于6 000,故該方法可行。

      2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

      通過以上色譜條件測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,數(shù)據(jù)經(jīng)過回歸處理,得芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的回歸方程分別為Y=9.0×104X-419(r=0.999 4)、Y=1.5×105X-1.5×104(r=0.999 8)、Y=6.7×105X-7.9×104(r=0.999 9),表明芍藥苷在0.066 5~1.663 2 μg、馬錢苷在0107 9~2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4~3.060 0 μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

      2.3 精密度試驗 分別連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣體積為10 μl,測得馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.57%、045%和0.30%,表明該方法的精密度良好。

      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年

      2.4 穩(wěn)定性試驗 按“1.3.5”方法操作,測得芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.32%、0.55%和0.46%,表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

      2.5 重復(fù)性試驗 按“1.3.6”方法操作,測得芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的平均含量分別為0.377 0(RSD=0.28%)、0.603 0(RSD=0.57%)、3.990 4 mg/粒(RSD=1.20%),表明該方法重復(fù)性好。

      2.6 加樣回收率試驗

      由表2~4可見,芍藥苷、馬錢苷、丹皮酚的平均回收率分別為97.63%、97.66%、96.22%、RSD

      分別為0.82%、0.74%、1.21%,均達(dá)到相關(guān)要求,說明該方

      2.7 樣品含量測定 由表5可見,吉林撫松、四川泰華堂、修正藥業(yè)3個廠家的樣品用該方法均能檢出芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚及其含量,表明該方法準(zhǔn)確、可靠,可推廣用于六味地黃膠囊的質(zhì)量控制。

      3 討論

      3.1 檢測波長的選擇 試驗前查參考文獻(xiàn)[13]得知芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的最大吸收波長分別為230、236和274 nm。由于所用檢測器為雙波長檢測器,故丹皮酚選擇其最大吸收波長274 nm;而芍藥苷的最大吸收波長230 nm與馬錢苷的最大吸收波長236 nm比較接近,故通過試驗選擇芍藥苷和馬錢苷共用的波長。取同一供試品溶液進(jìn)樣10 μl,分別在230和236 nm波長下測定芍藥苷和馬錢苷的含量,結(jié)果顯示(表6),由于230和236 nm 2個波長比較接近,所以含量測定時影響不大,但由于芍藥苷含量比馬錢苷低,所以選擇了芍藥苷的最大吸收波長230 nm為芍藥苷和馬錢苷的共用檢測波長。

      3.2 流動相的選擇 由于是3種物質(zhì)同時進(jìn)行分離,芍藥苷、馬錢苷2個苷類物質(zhì)的極性與丹皮酚酚酸類物質(zhì)極性相差較大,如果僅采用等度洗脫,很難完全、快速地將3種物質(zhì)分離,故采用梯度洗脫。開始水相的比例較大,流動相極性較大,將同樣極性較大的芍藥苷和馬錢苷洗脫處理;然后再逐漸加大甲醇的比例,降低流動相極性,將極性較小的丹皮酚洗脫出來;最后由于六味地黃膠囊為中藥復(fù)方提取物,雜質(zhì)較多,反復(fù)進(jìn)樣,易導(dǎo)致色譜柱的柱效下降,且由于采用自動進(jìn)樣,連續(xù)進(jìn)樣后會出現(xiàn)雜質(zhì)峰干擾,因此最后用高濃度甲醇溶液沖洗雜質(zhì)一段時間。試驗開始時使用的為0.05%的磷酸溶液,但芍藥苷色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重,故加大酸性,采用0.1%的磷酸溶液,峰型因此變得比較對稱。同時試驗中發(fā)現(xiàn),芍藥苷與馬錢苷的極性比較接近,最開始采用的為甲醇∶0.1%磷酸(25∶75),兩峰大部分重合,逐漸增加水相比例,降低溶劑強(qiáng)度,比例為甲醇∶0.1%磷酸(20∶80)時才使兩峰達(dá)到基線分離。

      3.3 提取溶劑的選擇

      取同一批次樣品(批號120202 85),取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇和甲醇各25 ml,稱定重量,超聲處理(500 W,40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減少的重量,搖勻,濾過,續(xù)濾液用0.45微孔濾膜濾過,分別測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量。結(jié)果顯示(表7),以甲醇為提取溶劑時馬錢苷與丹皮酚的提取含量最高,以50%甲醇為提取溶劑時芍藥苷的提取含量最高,從含量以及操作方面綜合考慮,選擇甲醇為提取溶劑,與2010版中國藥典品種六味地黃膠囊采用溶劑無差別。

      3.4 提取時間的選擇

      取同一批次樣品(批號120202 85),取約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 ml,稱定重量,分別超聲處理(500 W,40 kHz)20、30、40 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻,濾過,續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜濾過,分別測定芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚的含量。結(jié)果顯示(表8),超聲30 min基本已提取完全,故超聲時間選擇30 min。

      3.5 小結(jié)

      芍藥苷、馬錢苷和丹皮酚均具有明確的藥理作用,屬六味地黃膠囊方中的重要有效成分。該試驗建立了同時測定六味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚3種成分含

      量的反相高效液相色譜法(RPHPLC),結(jié)果表明,芍藥苷在0.066 5~1.663 2 μg、馬錢苷在0.107 9~2.697 7 μg、丹皮酚在0.122 4~3.060 0 μg范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.999 4、0.999 8、0.999 9,平均回收率分別為芍藥苷97.63%(RSD=0.82%)、馬錢苷97.66%(RSD=0.74%)、丹皮酚96.22%(RSD=1.21%)??梢?,六味地黃膠囊樣品中丹皮酚的含量均符合中國藥典2010版不得低于規(guī)定0.3 mg/粒的規(guī)定[1]。這樣同時測定3個成分,能同時檢測六味地黃膠囊中牡丹皮和酒萸肉的含量,更加方便、快捷和具有代表性。同時該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性好,可更科學(xué)、全面地用于六味地黃膠囊質(zhì)量控制和評價。

      參考文獻(xiàn)

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