羊草CDPK基因全長cDNA的克隆及原核表達

崔喜艷，秦思余，劉忠野，高 瑜，蔣載陽，郭繼勛

(1 吉林農業(yè)大學 生命科學學院，吉林 長春130118;2 東北師范大學 草地研究所/植被生態(tài)科學教育部重點實驗室，吉林 長春130024)

鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK)屬于Ser/Thr 型蛋白激酶［1］．外界逆境信號能夠引起細胞質中Ca2+濃度發(fā)生變化，產生鈣信號，激活相應的CDPK 組分，CDPK 催化底物發(fā)生磷酸化作用，通過特定的通路調控下游基因表達，從而調控生物生理生化代謝、水分代謝和離子跨膜運輸以及激素調控等對信號響應的生物學過程［2-4］．目前，已從小麥、玉米、水稻等作物中分離得到CDPKs 基因［5-7］，并證實該基因在植物受到外界逆境脅迫下表達量發(fā)生變化．研究表明，植物在非生物脅迫過程中，CDPK 在逆境信號轉導過程中具有重要的作用［8］．

由于一系列人為因素的干擾及過度放牧，使得草地鹽堿化、沙漠化面積日益擴大［9］．羊草Leymus chinensis 又名堿草，隸屬禾本科賴草屬，是歐亞大陸東部草甸草原及干旱草原上重要建群種之一［10］．在中國主要分布于東北、華北等地區(qū)，羊草本身具有較強的耐鹽堿、干旱等特性［11］．目前，關于羊草CDPK基因相關的研究報道較少，羊草對鹽堿的耐受性及適應不同逆境的分子機制還不明確．本試驗對羊草CDPK 基因進行克隆及原核表達，不僅可以豐富禾本科植物CDPK 基因的信息，而且為今后探討羊草適應鹽堿生境分子機制提供理論基礎．

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 植物材料及培養(yǎng) 供試材料為羊草，2011年種子取自吉林省長嶺縣東北師范大學草原生態(tài)定位研究站．盆栽砂培，光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，白天(26.0±0.5)℃，夜晚(15.0 ±0.5)℃，照光12 h，每天08:00—08:30澆水50 mL，出苗后每天澆1 次Hoagland 營養(yǎng)液［12］，取生長4 周的羊草葉片為試驗材料．

菌株和質粒:大腸埃希菌Escherichia coli DH5-α、BL21(DE3)及載體pET30a(+)為吉林農業(yè)大學生命科學學院生物化學與分子生物學研究室保存，pMD18-T 購于大連寶生物工程有限公司．

試劑和酶類制劑:RACE 試劑盒購自Clontech 公司;Trizol 購自Gibco 公司;反轉錄酶AMV、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)均購于Promega 公司，所有限制性內切酶NdeⅠ、XhoⅠ、Ex-Taq 酶、T4 DNA 連接酶和DNA 相對分子質量標準、蛋白質相對分子質量標準均購于大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒為AxyGEN 公司產品．其他試劑均為國產分析純．

1．1．2 引物設計 應用Primer5.0 軟件，根據(jù)NCBI中已經發(fā)表禾本科的CDPK 基因cDNA 序列，在基因保守區(qū)設計1 對簡并引物，擴出中間片段，經測序驗證后，重新設計引物，通過5'RACE 和3'RACE 分別獲得5'和3'端未知序列，重疊序列拼接后重新設計帶酶切位點的引物．引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物純度為PAGE 級．本研究所用引物列于表1．

表1 羊草CDPK 基因克隆中所用引物Tab．1 Primers used in cloning of CDPK gene from Leymus chinensis

1．2 方法

1．2．1 羊草葉片總RNA 的提取 取羊草葉片1 g在研缽(加入液氮)中研磨成粉，迅速放入1.5 mL 無RNase 的離心管中，加入1 mL Trizol 混勻，其余步驟按試劑盒說明書操作，－70 ℃條件冰柜保存總RNA．

1．2．2 羊草cDNA 的合成 按Promega 試劑盒操作，取2.5 μL 的羊草總RNA，加入OligdT 2.0 μL，焦碳酸二乙酯(DEPC)處理H2O 5.5 μL，70 ℃5 min后冰浴5 min;再依次加入下列其余成分:5×AMV Buffer 5.0 μL，10 mmol·L－1dNTP 2.5 μL，RNasin 0.5 μL，AMV 0.5 μL，DEPC 處理H2O 6.5 μL，42 ℃條件60 min，95℃條件5 min．反應結束后獲得羊草cDNA 液，－20 ℃條件冰柜保存．

1．2．3 羊草CDPK 基因的克隆 中間片段的擴增:以合成的羊草cDNA 液為模板，進行RT-PCR 反應，50 μL 反應體系，94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火40 min，72 ℃延伸2 min，30 次循環(huán);72 ℃延伸10 min．利用凝膠DNA 回收試劑盒將PCR 產物中的目的條帶回收純化，連接到pMD18-T 載體上，轉化大腸埃希菌DH5-α 感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆經PCR 和酶切鑒定后，送至上海生工生物工程有限公司測序．

3'RACE 擴增:以合成cDNA 為模板，用CDPK3S1 和CDPK3S2 分別與B26 為引物，進行嵌套PCR，50 μL 反應體系，第1 次退火溫度66 ℃，以第1次PCR 產物為模板，第2 次退火溫度58 ℃;回收，連接，轉化，鑒定，測序．

5'RACE 擴增:同3'RACE 擴增，利用CDPK5S 分別與CDPK5A1 和CDPK5A2 進行嵌套PCR，50 μL反應體系，第1 次退火溫度56 ℃，以第1 次PCR 產物為模板，第2 次退火溫度59 ℃;回收，連接，轉化，鑒定，測序．

采用生物學軟件DNAman 對測定的序列進行分析，發(fā)現(xiàn)中間片段測序結果與5'RACE 擴增結果有27 個堿基重疊，與3'RACE 有64 個堿基重疊．電子合并后，獲得拼接全長cDNA 序列．在該cDNA 序列開放閱讀框兩端設計引物LcCDPKS 和LcCDPKA，以cDNA 為模板，擴增出完整的羊草CDPK cDNA 的全長序列，將之命名為:Lc-CDPK;重新設計上、下游分別帶NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點的引物CDPKS 和CDPKA，用于構建原核表達重組載體．

1．2．4 原核表達載體pET-30a-CDPK 的構建與鑒定試驗過程及方法均參照文獻［13］．

1．2．5 重組質粒在大腸埃希菌中的誘導表達及SDS-PAGE 電泳 試驗過程及方法均參照文獻［14］．

2 結果與分析

2．1 羊草葉片總RNA 的提取

Trizol 法提取羊草葉片總RNA，用10 g·L－1瓊脂糖凝膠進行變性電泳，結果(圖1)顯示，有3 條電泳帶，從上到下依次為28S rRNA、18S rRNA 和5S rRNA，條帶清晰．表明提取的RNA 完整性較好，濃度比例符合要求;經紫外分光光度計檢測，D260nm/D280nm為2.009，說明總RNA 純度高，可用于反轉錄等后續(xù)試驗．

圖1 總RNA 的電泳結果Fig．1 The electrophoresis of total RNA

2．2 羊草CDPK 基因的克隆與分析

2．2．1 羊草CDPK 基因的克隆 中間片段的擴增:根據(jù)NCBI 中已經發(fā)表禾本科的CDPK 基因的氨基酸序列，在基因保守區(qū)設計1 對簡并引物S1、A1，以羊草葉片總RNA 為模板，以OligdT 為反轉錄引物，合成單鏈cDNA，利用簡并引物S1、A1 進行RT-PCR反應，獲得590 bp 的目的片段(圖2)．

圖2 Lc-CDPK 基因PCR 擴增結果Fig．2 The PCR amplification of Lc-CDPK gene

3'RACE 擴增:以合成的單鏈cDNA 為模板，利用CDPK3S1 和CDPK3S2 分別與B26 進行嵌套PCR，得653 bp 片段;5'RACE 擴增:以合成的單鏈cDNA 為模板，利用CDPK5S 分別與CDPK5A1 和CDPK5A2 進行嵌套PCR，得864 bp 片段;將3 次測序的片段用軟件分析，經重疊序列拼接后，在該cDNA序列開放閱讀框兩端設計帶酶切位點的引物，擴增出羊草CDPK 基因全長cDNA 片段1 704 bp，見圖2．

2．2．2 羊草CDPK 基因的生物信息學分析 Prot-Param(http://us．expasy．org/tools/protparam．html)在線分析，對所推演的氨基酸序列進行分析，結果可知:CDPK 基因編碼的氨基酸序列氨基酸數(shù)548 個，相對分子質量為61349，理論等電點5.34，正、負電荷殘基總數(shù)分別是65 和83，在組成CDPK 蛋白的20種編碼氨基酸中亮氨酸所占比例最高，達到9.9%，而色氨酸所占比例最低，僅為0.9%．

采用SMART(http://smart．embl-heidelberg．de/)分析，結果(圖3)得知:第81～339 個氨基酸序列構成具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc 結構域，第386～414、422～450、458～486、492～520 這4 段氨基酸序列均為EF 手型結構域．這與其他種類禾本科植物中CDPK 蛋白激酶結構域有相同之處［13］．

根據(jù)SignalP4.1 server 對所預測的氨基酸序列進行分析，該蛋白無信號肽;多肽鏈N 端起始氨基酸序列為“MGNQNGT”，該序列是具有豆蔻?；妥貦磅；饔盟匦璧谋Ｊ匦蛄蠱Gx xC(S/ Q )x xT［15-16］，推測其可能定位于膜上，與SignalP4.1 server 預測結果一致．

圖3 Lc-CDPK 基因的核苷酸及氨基酸序列Fig．3 The nucleotides sequence and amino acids sequence of Lc-CDPK gene

2．3 不同物種CDPK 基因的相似性比對

使用DNAman 軟件對克隆所得到的羊草CDPK基因與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的4 種禾本科主要作物CDPK1 基因進行對比，開放閱讀框內核苷酸相似性分別為:高粱82%，水稻75%，玉米67%，與小麥CDPK1 基因的相似性最高，相似度為96%(圖4)．同時將克隆結果與小麥CDPK1 基因家族其他CDPKs 基因進行比對，并構建系統(tǒng)進化樹(圖5)，比對結果仍舊表明與小麥CDPK1 基因相似性最高．由此可知，從羊草中克隆的序列為CDPK1 基因，而非CDPK 基因家族的其他成員．

圖4 Lc-CDPK 基因與4 種禾本科作物CDPK 基因編碼框相似性關系分析Fig．4 Similarity analysis of gene ORF between Lc-CDPK gene and CDPK1 genes of four Graminaceous crops

圖5 Lc-CDPK 基因與小麥17 個CDPK 基因編碼框相似性分析Fig．5 Similarity analysis of gene ORF between Lc-CDPK gene and seventeen CDPK genes of wheat

2．4 原核表達載體的構建

將目的基因Lc-CDPK 和pET-30a(+)分別進行NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切并切膠回收目的片段，將兩者16℃過夜連接，連接產物42 ℃條件下熱激轉化E．coli BL21 感受態(tài)細胞中，通過Kan 進行抗性篩選，獲得陽性克隆菌落;挑取單菌落提取質粒并進行PCR 和雙酶切驗證(圖6)．結果證明原核重組質粒pET-30a-CDPK 構建成功．將鑒定正確的陽性克隆菌的重組質粒轉化E．coli BL21 感受態(tài)細胞，用于誘導融合蛋白的表達．

圖6 重組質粒pET-30a-CDPK 的PCR 及雙酶切驗證結果Fig．6 The verification of recombinant plasmid pET-30a-CDPK by PCR and restriction enzyme digestion

2．5 融合蛋白SDS-PAGE 電泳

將含有pET-30a-CDPK 的E．coli BL21 陽性單菌落過夜擴大培養(yǎng)，當菌液D600nm達到0.6 左右時，加IPTG(終濃度為1 mmol·L－1)誘導培養(yǎng)，誘導7 h．每隔1 h 取1 mL 菌液，共取7 次，用123.2 g·L－1分離膠SDS-PAGE 進行電泳分析．從圖7 可看出，經IPTG 誘導的細菌可大量表達相對分子質量61 350的特異蛋白，而未經IPTG 誘導的細菌(對照)不表達或表達量很少．表達產物相對分子質量與預計理論值相符．利用BandScan5.0 軟件分析后發(fā)現(xiàn)，IPTG 誘導7 h 的蛋白含量最高，表達量可占菌體總蛋白的49.1%．證明原核表達載體構建正確，核苷酸序列無移碼現(xiàn)象．

圖7 融合蛋白的SDS-PAGE 分析Fig．7 SDS-PAGE analysis of fusion protein

3 討論

1982年Hetherington 等［17］在豌豆中首先報道了CDPKs，自Harper 等［18］首次克隆了大豆CDPK 基因以后，人們對CDPK 基因的研究日益關注，迄今已在動物、植物及原生生物克隆了近百種CDPK 基因［19］．CDPKs 是一個多基因家族，其中擬南芥有34 個CDPKs［20］．CDPKs 在植物整個生長發(fā)育過程中，幾乎參與所有生理生化代謝過程，如調節(jié)離子和水分運輸［21］，調節(jié)保衛(wèi)細胞和氣孔運動［22］，參與植物碳氮代謝［23］，參與對植株生長和發(fā)育的調控［24］，參與植株激素代謝和激素信號的轉導［25］，對病原菌侵害的響應與防御［26］，以及對環(huán)境脅迫的應答和抗逆［27］．

本研究從耐鹽堿的禾本科牧草——羊草中成功克隆了CDPK 基因，將其命名為Lc-CDPK，對Lc-CDPK 分析后可知:全長cDNA 序列為1 704 bp，包括1個1 647 bp 的開放閱讀框，編碼548 個氨基酸，第81～339 個氨基酸序列構成具有絲氨酸/蘇氨酸激酶催化活性的S-TKc 結構域，有4 個保守的EF 手性結構，EF 手型結構域是鈣結合基序;鈣離子結合誘導的EF 手基序的構象變化，從而導致靶蛋白的活化或失活［13］．核苷酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的4 種禾本科主要作物小麥、高粱、水稻和玉米CDPK1 核苷酸的相似性均較高，與小麥CDPK1 相似性高達96%．說明從羊草中克隆出的CDPK 基因為CDPK1．本試驗結果為CDPKs 家族增加了新成員．小麥CDPK1 基因對低磷逆境產生了應答，通過上調表達，參與小麥植株對低磷逆境信號的轉導、響應或抵御過程［5］;當植物或細胞受到外部信號刺激時，胞質內Ca2+濃度發(fā)生變化，經Ca2+的受體蛋白、鈣調素(CaM)和CDPK 基因等協(xié)同完成特定信號的傳遞［4］;小分子滲透調節(jié)物質的大量積累及抗氧化酶系統(tǒng)的調節(jié)是羊草群落對不同鹽堿化草地適應的重要生理響應［28］．說明一定鹽堿條件的生境，羊草均能生長，CDPK 基因應答的Ca2+調解機制亦可能是主要原因．

本試驗構建了重組質粒pET-30a-CDPK，在原核生物中進行誘導表達，SDS-PAGE 分析看出，經IPTG誘導的細菌可大量表達相對分子質量61 350 的特異蛋白，而未經IPTG 誘導的細菌(對照)不表達或表達量很少．表達產物大小與預計理論值相符，表明從羊草中克隆的CDPK 基因核苷酸序列正確，無移碼現(xiàn)象．目前，SDS-PAGE 純化融合蛋白的結果已作為抗原，正在用于進一步有關羊草CDPK 基因細胞的定位研究．羊草CDPK 基因的克隆及在原核生物中成功的誘導表達，為今后克隆羊草中其他CDPKs 基因提供試驗方法，為構建真核表達載體研究羊草CDPK 基因的功能，以及羊草適應鹽堿生境分子機制等研究提供理論依據(jù)．

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