小麥戊聚糖對2型糖尿病小鼠腸道菌群和血糖的影響

沈麗娟,王倩Δ,胡源

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)科，江蘇 無錫 214071；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 無錫 214071)

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小麥戊聚糖對2型糖尿病小鼠腸道菌群和血糖的影響

沈麗娟1,王倩1Δ,胡源2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院 重癥監(jiān)護(hù)科，江蘇 無錫 214071；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 無錫 214071)

目的 研究小麥戊聚糖對2 型糖尿病小鼠腸道菌群和血糖的影響。方法 昆明種小鼠30只，隨機(jī)分為3組，正常對照組，模型組，治療組，每組10只。以腹腔注射鏈佐霉素構(gòu)建糖尿病小鼠模型，治療組在普通飲食基礎(chǔ)上加用小麥戊聚糖制劑灌胃[6.7g/(kg·bw)]。觀察造模后3周采用葡萄糖氧化酶法測各組空腹血糖的變化，采用16S rRNA 實時熒光定量 PCR檢測小鼠腸道主要的菌群，比較各組菌群的差異。結(jié)果 鏈佐霉素誘導(dǎo)2型糖尿病后小鼠空腹血糖升高(P<0.05)，雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量下降(P<0.05)，且腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量與空腹血糖呈負(fù)相關(guān) (P=0.001，r=-0.918；P=0.019，r=-0.718)。灌胃小麥戊聚糖制劑后，小鼠空腹血糖逐漸降低(P<0.05)，腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量有所恢復(fù)。結(jié)論 2型糖尿病小鼠腸道菌群發(fā)生紊亂，小麥戊聚糖制劑能調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠腸道菌群紊亂，降低血糖水平。

小麥提取物；戊聚糖；2型糖尿病；腸道菌群；血糖

隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖、糖尿病等疾病患病率呈上升趨勢，已成為全球突出的社會問題之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與肥胖、糖尿病發(fā)病密切相關(guān)[2]，肥胖及糖尿病患者腸道菌群紊亂，益生菌數(shù)量下降[3]。研究發(fā)現(xiàn)，谷物膳食纖維對肥胖、2型糖尿病有治療作用[4]。戊聚糖又名阿拉伯木聚糖，是谷物膳食纖維的主要成分。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型[5]，灌胃小麥提取物戊聚糖制劑后觀察其空腹血糖、腸道菌群等變化，研究小麥戊聚糖對2型糖尿病是否具有治療效果，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性昆明種小鼠30只，體質(zhì)量(25±3) g，由上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，合格證號為：SYXK(滬)2008-0016，合格證號：2008001624801。小鼠飼養(yǎng)和實驗均在南京醫(yī)科大學(xué)動物中心實驗室內(nèi)進(jìn)行。小鼠接收后放入實驗環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度20 ℃～25 ℃，濕度40%～70%，12h光照。飼以實驗動物用配合飼料，自由進(jìn)食飲水,本實驗遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.2 儀器及試劑 耐高溫a-淀粉酶由無錫杰能科生物工程有限公司提供。Dcode變性梯度凝膠電泳系統(tǒng)、凝膠成像Gel DocTM XR 系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)，PCR 儀(ABI，USA)。QIAamp糞便DNA 提取試劑盒(Cat .NO.51504)、乙二胺四乙酸(EDTA)、無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購自陜西眾美生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、蛋白酶 K、溶菌酶均購自上海生工生物公司；DNA分子標(biāo)準(zhǔn)Marker及TaqDNA多聚酶(Qiagen公司)。

1.3 小麥戊聚糖的制備 按鄭學(xué)玲等[6]方法提?。簩嶒炘闲←滬熎?上海馬來西亞面粉有限公司提供)用粉碎機(jī)粉碎后過篩，篩下物按W(麩皮):V(體積分?jǐn)?shù)為80的乙醇溶液)=1 g:5 mL的比例，離心分離出上清液；不溶物按質(zhì)量比1:10加入蒸餾水，并加入一定量的戊聚糖酶，60 ℃提取2 h；離心分離上清夜，將上清液加熱到95 ℃，加入適量的耐高溫ɑ-淀粉酶，保溫90 min，并不斷振蕩，然后冷卻到60 ℃，加入適量糖化酶，保溫1 h；然后用中性蛋白酶處理，以分解其中含有的蛋白質(zhì)，加熱到100 ℃，并保溫20 min進(jìn)行滅酶處理；離心分離上清夜，濃縮上清液至一定體積，然后加入4倍體積的乙醇，在4 ℃靜止，過夜；離心收集沉淀，沉淀部分加一定量水溶解，濃縮去除殘余的乙醇，得到水溶性戊聚糖。隨后放入 85 ℃的烘箱里烘干得到成品，成品為黃白色粉末，提取率為60%，即1000 g小麥麩皮得出600g戊聚糖成品。將600 mL蒸餾水直接加入600 g粉末中混勻后微孔篩過濾配成1 g/mL濃度溶液供實驗用。

1.4 造模及分組 取小鼠30只，分為正常對照組(10只)，糖尿病模型組(20只) 。糖尿病模型采用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4.4)稀釋STZ，按200 mg/kg體重腹腔注射，3d后尾靜脈采血測血糖(葡萄糖氧化酶法)，血糖>11.1 mmol/L確定為糖尿病模型小鼠，造模失敗者剔除。正常對照組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。造模成功后隨機(jī)分為2組：模型組及治療組。模型組除飼以實驗動物用配合飼料，自由進(jìn)食飲水外，不進(jìn)行特殊處理。治療組給予灌胃6.7 g/(kg·bw)小麥戊聚糖溶液，每天1次，其余時間飼以實驗動物用配合飼料，自由進(jìn)食飲水，共治療觀察3周。

1.5 血糖測定 每組小鼠治療前及開始治療后每周周一空腹?fàn)顟B(tài)采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖值，直至3周后實驗結(jié)束。

1.6 腸道細(xì)菌測定 糞便標(biāo)本采集及DNA提取：以無菌方法取小鼠的新鮮糞便，置于無菌試管內(nèi)，快速保存于-280 ℃低溫冰箱內(nèi)。稱取0.2 g糞便標(biāo)本，使用QIAamp糞便DNA提取試劑盒，根據(jù)試劑盒說明提取糞便細(xì)菌總DNA。

設(shè)計引物及PCR擴(kuò)增：根據(jù)長雙歧桿菌、乳酸桿菌16S rDNA基因序列，應(yīng)用引物設(shè)計軟件PrimerPremier設(shè)計相應(yīng)菌屬PCR引物。雙歧桿菌屬(350 bp)F:5’-ACCCTGGTAGTCC-ACGCCGTAA-3’；R:5’-GGCACAATCCGCTGGCAACA-3’。乳酸桿菌屬(165 bp)F:5’-ACGGGAGGCAGCAGTAGGGA-3’；R:5’-AGCCGTGACTTTCTGGTTGATT-3’；制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以各標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)處理后所得的DNA片段作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品。以PCR反應(yīng)過程中出現(xiàn)熒光信號的初始循環(huán)數(shù)(C)為縱坐標(biāo)，以各模板不同拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到截距(b)，斜率(k)及相關(guān)性，最后利用回歸方程式：log Co=(Cn-b)/k，將所得各標(biāo)本的初始循環(huán)數(shù)代入公式，即得到對應(yīng)的DNA模板數(shù)；

糞便細(xì)菌16S rDNA定量分析：將糞便樣品中提取的DNA分別進(jìn)行2種細(xì)菌16S rDNA熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時相同。每次實驗同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板的陰性對照，每個樣品均同時做3個平行復(fù)孔。反應(yīng)完畢后根據(jù)融解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠空腹血糖的變化 造模成功后，糖尿病模型組造模后小鼠空腹血糖與正常對照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組每周空腹血糖逐漸下降，第2周及第3周空腹血糖水平與造模后相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；第3周空腹血糖水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 小鼠空腹血糖變化情況Tab.1 Changes of fasting blood glucose in ±s，mmol/L)

*P<0.05，與正常對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與造模后比較，compared with after modeling

2.2 腸道菌群的變化 造模成功后，糖尿病模型組小鼠腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量下降，與造模前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；治療組每周腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量逐漸升高；至第3周腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量逐漸恢復(fù)，雙歧桿菌與造模后相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，乳酸桿菌數(shù)量與造模前、后相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 小鼠腸道菌群的變化情況±s)Tab.2 Changes of intestinal flora status in mice ±s)

*P<0.05，與造模前比較，compared with before modeling；#P<0.05，與造模后比較，compared with after modeling

擴(kuò)增曲線見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，融解曲線見圖3。

圖1 2種菌屬的擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of 2 genus bacteria

圖2 2種菌屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of 2 genus bacteria

圖3 2種菌屬的融解曲線Fig.3 Melting curve of 2 genus bacteria

2.3 腸道菌群與空腹血糖的關(guān)系 造模成功后雙歧桿菌與空腹血糖呈負(fù)相關(guān) (P=0.001，r=-0.918)，乳酸桿菌的數(shù)量與空腹血糖呈負(fù)相關(guān)(P=0.019，r=-0.718)，見圖4。

圖4 雙歧桿菌、乳酸桿菌與空腹血糖相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of bifidobacterium, lactobacillus and fasting glucose

3 討論

隨著生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖、糖尿病等疾病患病率呈上升趨勢，已成為全球突出的社會問題之一[1]。糖尿病是一組病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明的內(nèi)分泌代謝性疾病。近期大量研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群紊亂參與了糖尿病的發(fā)生與發(fā)展[2]，糖尿病患者腸道菌群紊亂，益生菌數(shù)量下降，腸桿菌及腸球菌數(shù)量上升[3-7]。大量的動物實驗及臨床研究證實了上述理論結(jié)果。白永亮等[8]發(fā)現(xiàn)，糖尿病SD大鼠雙歧桿菌數(shù)量顯著低于正常大鼠，且乳酸桿菌數(shù)量也已經(jīng)顯著低于正常大鼠。也有研究者發(fā)現(xiàn)[9]，糖尿病小鼠腸道內(nèi)大腸桿菌和鏈球菌數(shù)量顯著升高,而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量明顯下降。劉海霞等[10]利用16S RNA定量PCR方法發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者的雙歧桿菌數(shù)目顯著低于非糖尿病個體，腸糞球菌數(shù)目高于非糖尿病個體。

本研究通過STZ構(gòu)建2型糖尿病模型，采用16SrDNA熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量下降，并與血糖呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與既往研究結(jié)果一致[11-12]。腸道菌群紊亂引起糖尿病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制主要是：增加食物中能量、引起慢性低度炎癥、影響脂肪酸的代謝、分泌腸衍生肽等[13]。腸道菌群能調(diào)節(jié)能量守恒，從飲食中獲取能量，以甘油三酯儲存，通過脂肪酸氧化進(jìn)行能量消耗，從而調(diào)節(jié)飲食誘導(dǎo)的肥胖、胰島素抵抗和糖尿病[11]。腸道菌群紊亂導(dǎo)致革蘭氏陰性桿菌相對增多，腸道菌群紊亂，腸黏膜通透性增加，細(xì)菌移位，此時腸道產(chǎn)生和吸收較多的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，LPS和固有免疫細(xì)胞表面的CD14-Toll 樣受體(toll like receptors，TLR4)形成復(fù)合物結(jié)合激活炎性反應(yīng)，從而產(chǎn)生胰島素抵抗、損傷β細(xì)胞分泌功能，引起或促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[3]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，谷物膳食纖維對肥胖、2型糖尿病有治療作用[4]。研究表明，增加谷物膳食纖維的攝入能夠調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂、改善腸粘膜屏障功能，對糖尿病、肥胖具有預(yù)防作用[14]。戊聚糖又名阿拉伯木聚糖，是谷物膳食纖維的主要成分。戊聚糖在結(jié)腸部位能被特定的細(xì)菌所降解，對雙歧桿菌和乳酸桿菌等有增殖作用。研究表明[15]，從人結(jié)腸組織分離的乳酸桿菌能夠利用燕麥戊聚糖及其酶解產(chǎn)物而增殖。本研究給予2型糖尿病小鼠小麥戊聚糖灌胃，發(fā)現(xiàn)治療后小鼠空腹血糖水平下降，腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量較治療前恢復(fù)，與文獻(xiàn)報道一致。膳食纖維不能被人體胃腸道消化，但在結(jié)腸會成為腸道微生物的作用底物而被選擇性地分解和發(fā)酵，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，這些短鏈脂肪酸既能被宿主腸壁快速吸收利用，又能被腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌利用，從而促進(jìn)有益菌增殖，同時通過降低腸道pH值，抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長，減少有毒產(chǎn)物的形成，從而改善腸道微環(huán)境，保護(hù)腸粘膜屏障功能[16]。

2型糖尿病腸道菌群發(fā)生紊亂，雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量下降，可能參與了2型糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。小麥戊聚糖制劑能調(diào)節(jié)2型糖尿病小鼠腸道菌群紊亂，降低血糖水平?？梢宰鳛樘悄虿』颊叩奶妓衔锏闹饕獊碓?。但本研究僅限于動物實驗，觀察腸道菌群也僅限于雙歧桿菌及乳酸桿菌。在進(jìn)一步研究中，臨床實驗將擴(kuò)大樣本量，觀察更多的腸道菌群，以期為小麥戊聚糖制劑應(yīng)用于臨床提供更多的理論依據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Effect of wheat pentosans on intestinal flora and plasma glucose in diabetic mice

SHEN Li-juan1,WANG Qian1Δ,HU Yuan2

(1.Department of ICU, Wuxi Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Wuxi 214071, China; 2.Department of Endocrinology, Wuxi Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Wuxi 214071, China)

ObjectiveTo investigate the effect of wheat pentosans on intestinal flora and plasma glucose in type 2 diabetic mice.Methods30 Kunming mice were randomly divided into normal control group, model group, treatment group, 10 mice in each group.The animal model was established by intraperitoneal injection of streptozocin (STZ).The treatment group was orally administrated by gavaged with wheat pentosans[6.7 g/(kg·bw)].The levels of plasma glucose were measured by glucose oxidase method 3 week later.Total DNA was extracted from collected stool samples and submitted to real-time quantitative PCR (qPCR) with region of the 16S rRNA gene.ResultsThe plasma glucose levels in model group increased (P<0.05).The bifidobacteriumand lactobacilli counts decreased significantly(P<0.05).The bifidobacterium and lactobacilli counts were significantly negatively correlated with plasma glucose concentration (P=0.001,r=-0.918;P=0.019,r=-0.718). After given wheat pentosans to mice, the mice’s plasma glucose decreased(P<0.05).The counts of bifidobacterium and lactobacilli were several returned. ConclusionThere exists intestinal flora disorder in type 2 diabetes mice, the wheat pentosans can reduce the levels of plasma glucose in type 2 diabetic mice and modulate the mice intestinal flora.

wheat extract; pentosans;type 2 diabetes;intestinal flora; plasma glucose

沈麗娟，女，碩士，博士在讀，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)研究．E-mail：panda55@163.com；王倩，通訊作者，女，學(xué)士，副主任醫(yī)師，研究方向：重癥醫(yī)學(xué)研究工作，E-mail：zhangwangqian72@sina.com。

R587.1

A

1005-1678(2015)02-0028-04