鉬對小鼠睪丸組織中MAPK信號通路的影響及其對雄性生殖系統(tǒng)的毒性機制研究

黎煜楓,畢聰明,王,肖銀霞,陳強,劉英姿

(遼寧醫(yī)學院研究生學院 畜牧獸醫(yī)系，遼寧 錦州 121001)

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鉬對小鼠睪丸組織中MAPK信號通路的影響及其對雄性生殖系統(tǒng)的毒性機制研究

黎煜楓,畢聰明Δ,王,肖銀霞,陳強,劉英姿

(遼寧醫(yī)學院研究生學院 畜牧獸醫(yī)系，遼寧 錦州 121001)

目的 探討鉬對小鼠睪丸組織中MAPK信號通路的影響，分析其對雄性生殖系統(tǒng)的毒性機制。方法 取雄性昆明系小鼠60只，隨機分為4組，每組15只，分別為生理鹽水對照組、低劑量組(鉬酸鈉，300 mg/kg)、中劑量組(鉬酸鈉，600 mg/kg)、高劑量組(鉬酸鈉，1200 mg/kg)。每日進行灌胃染毒，連續(xù)30 d，取出睪丸。采用熒光定量PCR檢測小鼠睪丸ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、p38基因mRNA表達。結果 低、中、高劑量組ERK2、JNK2、p38 mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)；低、中、高劑量組ERK1、JNK1 mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)；且呈劑量依賴性，隨著劑量的增加，ERK2、JNK2、p38 mRNA表達顯著降低，ERK1、JNK1 mRNA表達顯著升高(P<0.05)。結論 鉬在ERK、JNK、p38信號通路mRNA水平上對小鼠睪丸組織產(chǎn)生影響，鉬對雄性生殖系統(tǒng)損傷是通過激活ERK、JNK、p38通路的活性來調(diào)控的，且呈劑量依賴性。不同濃度鉬酸鈉中毒可損傷小鼠睪丸組織的MAPK信號通路。

鉬；小鼠睪丸組織；MAPK信號通路；雄性生殖系統(tǒng)

鉬是黃嘌呤氧化酶的組成成分，在動物機體生長發(fā)育過程中是必需微量元素，過量的鉬會對生長性能產(chǎn)生抑制作用[1-2]。它作為代謝酶的輔助因子發(fā)揮其活性作用[3]。睪酮是一種類固醇激素，具有廣泛的生理功能，其主要作用是維持生精[4]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一類細胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能夠于多種不同信號轉導途徑中充當信號轉導因子[5]。研究報道顯示，MAPR信號通路在生殖細胞的功能、發(fā)育、成熟以及凋亡中具有重要作用，并且參與了生殖細胞發(fā)育的多個過程，其中包括生殖細胞周期進程、生殖細胞凋亡以及精子發(fā)生、精子獲能、頂體反應。在哺乳動物細胞內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典的3條MAPK通路，分別為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)以及p38MAPK[6]。目前，關于鉬對小鼠睪丸組織中MAPK信號通路的影響及其對雄性生殖系統(tǒng)毒性機制的研究尚無報道。本文旨在通過研究鉬對小鼠睪丸組織中ERK、JNK、p38MAPK基因的mRNA表達，探討其對MAPK信號通路的影響，進而分析鉬對雄性生殖系統(tǒng)的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 4周齡雄性健康昆明系小鼠60只，體質(zhì)量(25±2)g，健康狀況良好，購自北京市實驗動物研究中心[合格證號：Scxk(京)-2002-0003]。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 試驗主要試劑及主要儀器 鉬酸鈉，粉末狀固體，飼料級，用生理鹽水溶解。D-3752高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；DNA Engine PCR 儀(Stratagene公司)；Trizol試劑(北京瑞達恒瑞科技發(fā)展有限公司)、核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司)；DYC-31D型電泳槽(北京市六一儀器廠)；DYY-7型轉移電泳儀(北京市六一儀器廠公司)；Mx3000P實時熒光定量PCR儀(Stratagene公司)。

1.3 試驗動物的飼養(yǎng)、分組及處理 60只小鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為4組，每組15只分別為生理鹽水對照組；低劑量組(鉬酸鈉300 mg/kg)；中劑量組(鉬酸鈉600 mg/kg)；高劑量組(鉬酸鈉1200 mg/kg)，每日進行灌胃染毒，每只0.5 mL，連續(xù)30 d。每周記錄體質(zhì)量，每天模擬日光12 h，保證飼喂條件衛(wèi)生。第30天摘眼球取血后，分離血清；頸椎脫臼處死小鼠，取出睪丸，置于液氮中過夜后，轉入-80 ℃保存。

1.4 方法

1.4.1 HE染色觀察睪丸組織形態(tài)學：取試驗小鼠睪丸剝離被膜，睪丸組織重量與預冷0.9%生理鹽水1:9倍稀釋，勻漿液于低溫離心機(4 ℃)離心10 min、3000 r/min，取上清液加入9倍生理鹽水稀釋成1%的組織勻漿。置于4%中性甲醛液固定。棄去福爾馬林液后，睪丸依次用蒸餾水沖洗、乙醇不同濃度逐步脫水、二甲苯浸染、浸蠟、包埋、修塊、切片、撈片、烤片，最后進行HE染色后固定。

1.4.2 睪丸組織中總RNA提?。撼槿∩睇}水組、低劑量組、中劑量組和高劑量組各組小鼠睪丸組織，采取Trizol法提取小鼠睪丸組織中的總RNA。具體操作如下：取60個5 mL EP管，加入1 mL Trizol試劑于每管中，給予標號后放于冰盒中，取出在-80 ℃下保存的睪丸組織，每份取50～100 mg，將所取睪丸組織根據(jù)標號放入對應的Trizol的EP管中，于冰浴下采用勻漿機勻漿，然后將勻漿液分別轉移至1.5 mL EP管中，于室溫條件下靜置5 min；再于各管中分別加入0.2 mL氯仿，用力搖動15 s，于室溫條件下靜置5 min，再于4 ℃條件下離心15 min，轉速為12000 r/min，取上清液，使用移液槍吸入1.5 mL置于新的EP管中，然后再加入冰預冷的75%乙醇1 mL，洗滌后沉淀，于4 ℃離心10 min，轉速為12000 r/min，棄上清液，空氣干燥5～10 min，但不能完全干燥，溶于50 μL的0.1%DEPC水中，置于4 ℃過夜助溶，再將每個樣品各分裝2管，每管4 μL，以備測定RNA濃度及反轉錄使用，將剩余RNA于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 熒光定量PCR檢測：提取的總RNA采用DEPC水將其調(diào)整為100 ng/μL，取2 ng，加1 μL逆轉錄引物與12 μL DEPC水混勻，置于65 ℃條件下5 min，冰上2 min，再分別加入4 μL 5×反應緩沖液，1 μL RNA酶抑制劑并且加2 μL 10mmol/L dNTP混合物，1 μL Revert Aid M-MuLV逆轉錄酶，混勻，然后在PCR儀上通過42 ℃條件下60 min，70 ℃條件下5 min，完成逆轉錄。然后于PCR中每個標本均設立檢測管與對照管，溫度設置為94 ℃條件下2 min，94 ℃條件下15s，60 ℃條件下1 min，共30個循環(huán)，再應用40 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。小鼠睪丸ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、p38 mRNA表達：按照美國國立生物技術信息中心公布的有關小鼠ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、p38基因序列，采取Primer Premier 3.0軟件進行引物的設計。引物序列見表1，其中F代表上游引物，R代表下游引物。

表1 熒光定量PCR的引物Tab.1 Real-time PCR primer

2 結果

2.1 不同組睪丸HE染色切片 由圖1結果可知，與對照組相比較，低、中劑量組生精上皮明顯變薄，生精細胞層數(shù)明顯減少，間隙增大，排列疏松，生精細胞核減少消失。高劑量組中，曲精小管的生精細胞大量壞死，脫落，曲細精管管腔基本消失，生精細胞間隙增大，出現(xiàn)大面積空泡，脫落的生精細胞分布于曲精小管管腔中。

圖1 不同組睪丸HE染色切片F(xiàn)ig.1 HE staining result in each group

2.2 目的基因擴增產(chǎn)物的鑒定 小鼠睪丸DNA模板進行Real-time PCR擴增后，每個基因分別隨機選取1個樣品進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果如圖2所示。圖中可視：每個泳道分別只有1條亮帶，無非特異性條帶產(chǎn)生。

圖2 目的基因擴增產(chǎn)物的鑒定M:marker;1.ERK1基因；2.ERK2基因；3.JNK1基因；4.JNK2基因；5.p38基因；6.陰性對照Fig.2 The identification of amplification products of target geneM:marker;1.ERK1gene；2.ERK2gene；3.JNK1gene；4.JNK2gene；5.p38gene；6.negative control

2.3 不同組小鼠睪丸ERK1和ERK2基因mRNA表達比較 由表2結果可知，低劑量組、中劑量組、高劑量組ERK1基因mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)；中劑量組和高劑量組ERK1基因mRNA表達顯著高于低劑量組(P<0.05)；高劑量組ERK1基因mRNA表達顯著高于中劑量組(P<0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組ERK2基因mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組ERK2基因mRNA表達顯著低于低劑量組(P<0.05)；高劑量組ERK2基因mRNA表達顯著低于中劑量組(P<0.05)。

表2 不同組小鼠睪丸ERK1和ERK2基因mRNA表達比較Tab.2 Comparison of ERK1 and ERK2 mRNA expression in each ±s)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與低劑量組比較，compared with low dose group；ΔP<0.05，與中劑量組比較，compared with middle dose group

2.4 不同組小鼠睪丸JNK1和JNK2基因mRNA表達比較 由表3結果可知，低劑量組、中劑量組、高劑量組JNK1基因mRNA表達顯著高于對照組(P<0.05)；中劑量組、高劑量組JNK1基因mRNA表達顯著高于低劑量組(P<0.05)；高劑量組JNK1基因mRNA表達顯著高于中劑量組(P<0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組JNK2基因mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)；中劑量組和高劑量組JNK2基因mRNA表達顯著低于低劑量組(P<0.05)；高劑量組JNK2基因mRNA表達顯著低于中劑量組(P<0.05)。

表3 不同組小鼠睪丸JNK1和JNK2基因mRNA表達比較Tab.3 Comparison of JNK1 and JNK2 mRNA expression in each ±s)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與低劑量組比較，compared with low dose group；ΔP<0.05，與中劑量組比較，compared with middle dose group

2.4 不同組對小鼠睪丸P38基因mRNA表達比較 由表4結果可知，低劑量組、中劑量組、高劑量組p38基因mRNA表達顯著低于對照組(P<0.05)；中劑量組和高劑量組p38基因mRNA表達顯著低于低劑量組(P<0.05)；高劑量組p38基因mRNA表達顯著低于中劑量組(P<0.05)。

表4 不同組對小鼠睪丸p38基因mRNA表達比較±s)Tab.4 Comparison of p38 mRNA expression in each ±s)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與低劑量組比較，compared with low dose group；ΔP<0.05，與中劑量組比較，compared with middle dose group

3 討論

雄性激素有很多種，包括睪酮、雄二酮、雄酮等，其中以睪酮的活性最高。雄激素在進入細胞后，可與胞漿內(nèi)的受體相結合形成復合物，進而發(fā)生變構透過核膜入核。進入細胞核的復合物會與染色質(zhì)上的DNA特異位點相結合，促進或抑制特定基因mRNA的表達，起到調(diào)節(jié)作用[7]。雄激素在促進雄性器官發(fā)育和雄性第二性征的維持，以及促進蛋白質(zhì)合成等方面都有重要作用。鉬是黃嘌呤氧化酶的組成成分，在動物機體生長發(fā)育過程中是必需微量元素，過量與缺乏鉬都會對生長性能產(chǎn)生抑制作用，所以鉬既是有毒物又是生物活性元素[8-9]。病理切片顯示，低、中劑量組生精上皮明顯變薄，生精細胞層數(shù)明顯減少，間隙增大，生精細胞核減少消失。高劑量組中，曲精小管的生精細胞大量壞死，脫落，曲細精管管腔基本消失，出現(xiàn)大面積空泡，脫落的生精細胞分布于曲精小管管腔中，嚴重破壞了睪丸的生理功能。

MAPK信號轉導通路是在各種動物體廣泛存在的一類真核細胞將信號轉導至胞內(nèi)發(fā)生細胞反應的重要信號系統(tǒng)。其中ERK是第一個發(fā)現(xiàn)的MAPK信號轉導途徑，同時也是哺乳動物中目前研究最透徹的一種MAPK信號通路。ERK主要參與調(diào)控細胞增殖、分化以及凋亡等，主要經(jīng)信號的反饋調(diào)控，然后與支架蛋白的相互作用及改變亞細胞定位實現(xiàn)[10]。而ERK1和ERK2是在所有命名為ERK的MAPK中研究最為透徹的。研究報道顯示，在大鼠睪丸支持細胞及小鼠生殖細胞的各個階段均存在ERK1和ERK2。精子的發(fā)生主要由最初的生殖細胞通過一系列系統(tǒng)的、復雜的變化，從而分化形成一類高度特異性的細胞，它是一種依賴于分泌調(diào)節(jié)的發(fā)育過程，而在這個過程中一些基因發(fā)揮著重要作用，若這些基因發(fā)生改變或缺失會致使精子出現(xiàn)阻斷或異形精子的生成，故而致使不育或生殖能力明顯減弱[11]。而ERK1和ERK2均參與了小鼠精子生成的各個環(huán)節(jié)。本文研究表明，低、中、高劑量組ERK1基因mRNA表達較對照組顯著增加(P<0.05)，提示鉬能夠影響小鼠睪丸生殖細胞的增殖與分化，并且機體保護機制可使這種影響弱化，故而保護生殖系統(tǒng)的健康。低、中、高劑量組ERK2基因mRNA表達較對照組顯著降低(P<0.05)，提示ERK2可能在鉬致雄性生殖損傷中發(fā)揮了作用。JNK又為應激活化蛋白激酶，其異構體均由JNK1、JNK2、JNK3編碼，JNK1/2可廣泛地在各種組織細胞中表達[12]。各種細胞因子、生長因子及應激刺激均能激活JNK信號通路。JNK信號通路支架蛋白被稱為c-Jun氨基末端激酶相關亮氨酸拉鏈蛋白(JLP)。研究報道顯示，JLP在小鼠睪丸中表達，并且缺乏JLP的小鼠生育率顯著下降，故而說明JNK間接參與了正常功能精子的產(chǎn)生[13]。本文研究結果表明，低、中、高劑量組JNK1基因mRNA表達較對照組顯著增加(P<0.05)，提示鉬可能通過激活JNK1通路介導細胞凋亡；低、中、高劑量組JNK2基因mRNA表達較對照組顯著降低(P<0.05)，提示鉬對小鼠生殖系統(tǒng)的毒性可能是經(jīng)激活JNK2信號通路，從而促進睪丸支持細胞的凋亡，故進一步影響正常精子的生長。p38是由360個氨基酸組成的一種38 kD的蛋白[14]。研究報道顯示，當睪丸受到刺激，如促卵泡激素、雌激素、睪丸的改變將通過激活p38信號通路，從而加快細胞凋亡。細胞因子與睪丸破壞血睪屏障的完整性是通過p38途徑途徑實現(xiàn)的[15]。本文研究報道顯示，低、中、高劑量組p38基因mRNA表達較對照組顯著降低(P<0.05)，提示鉬可能抑制了p38的磷酸化，故而降低細胞凋亡的持續(xù)發(fā)生，從而發(fā)揮保護性機制。綜上所述，鉬在ERK、JNK、p38信號通路mRNA水平上對小鼠睪丸組織產(chǎn)生影響，鉬對雄性生殖系統(tǒng)損傷時通過激活ERK、JNK、p38通路的活性來調(diào)控的，不同濃度鉬酸鈉中毒可損傷小鼠睪丸組織的MAPK信號通路。

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(編校：王儼儼,吳茜)

Effect of molybdenum on MAPK signaling pathways in mouse testis and its mechanism of male reproductive toxicity

LI Yu-feng,BI Cong-mingΔ,WANG Kun,XIAO Yin-xia,CHEN Qiang,LIU Ying-zi

(Department of Animal Science, Graduate School of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the effect of molybdenum on MAPK signaling pathway in mouse testis, and analyze the mechanisms of male reproductive system toxicity.Methods60 male Kunming mice were randomly divided into four groups, control group, low-dose group(molybdenum 300 mg/kg), middle-dose group(molybdenum 600 mg/kg), high-dose group(molybdenum 1200 mg/kg), 15 mice in each group.The mice were gavaged daily, continuous 30d, then removed the testicles.The mRNA expression of ERK1, ERK2, JNK1, JNK2, p38 gene in mice testis were detected by Real-time PCR.ResultsThe ERK2, JNK2, p38 mRNA expression in low-dose group, middle-dose group and high-dose group were significantly lower than those in control group(P<0.05); the ERK1,JNK1 mRNA expression in low-dose group, middle-dose group and high-dose group were significantly higher than those of control group(P<0.05); and dose-dependent manner with increasing dose, ERK2, JNK2, P38 mRNA expression significantly decreased, ERK1, JNK1 mRNA expression significantly increased(P<0.05). ConclusionThe molybdenum could affect mouse testis by regulating ERK, JNK, P38 mRNA levels of signaling pathway, while molybdenum on male reproductive system damage by activating the ERK, JNK, P38 in MAPK signaling pathway.

molybdenum; mouse testis; MAPK signaling pathway; male reproductive system

2013年遼寧省自然基金(2013022036)

黎煜楓，女，碩士，研究方向：遺傳學，E-mail：liyufeng00282@163.com；畢聰明，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：動物胚胎工程與生殖毒理，E-mail：bicongming747@163.com。

R781.42

A

1005-1678(2015)02-0010-04