NGX6基因聯(lián)合順鉑治療肺癌的體內(nèi)外研究

張敬，王哲，史曉宇，孟瑋，馬峰，王金，趙永明

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院 藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

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NGX6基因聯(lián)合順鉑治療肺癌的體內(nèi)外研究

張敬1，王哲2，史曉宇1，孟瑋1，馬峰1，王金3，趙永明3

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 泌尿外科，河北 張家口 075000；3.河北北方學(xué)院 藥學(xué)系，河北 張家口 075000)

目的 探討NGX6基因聯(lián)合順鉑對肺癌A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的體外抑制作用及其體內(nèi)抗腫瘤效果。方法 以脂質(zhì)體魚精蛋白為載體，構(gòu)建載NGX6基因的陽離子脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。將A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞均分為NGX6組(載NGX6基因的LPD，NGX6濃度為30 μg/mL)、順鉑組、NGX6+順鉑組，以PBS為陰性對照。采用MTT檢測各組對A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的生長抑制作用；克隆形成實(shí)驗(yàn)計(jì)算克隆形成率和抑制率；構(gòu)建肺癌移植腫瘤模型，將裸鼠分為同細(xì)胞處理相同的4組, 每組10只，統(tǒng)計(jì)各組裸鼠腫瘤體積和生存期，觀察各組裸鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力顯著強(qiáng)于NGX6組和順鉑(P<0.01)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NGX6+順鉑組的腫瘤細(xì)胞克隆數(shù)小于NGX6組和順鉑組(P<0.01)。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NGX6+順鉑組對荷瘤裸鼠的腫瘤生長抑制率顯著高于NGX6組和順鉑組(P<0.01)。NGX6+順鉑組，NGX6組，順鉑組和生理鹽水組荷瘤裸鼠的中位生存期分別為43、31、29、15d。結(jié)論 NGX6基因聯(lián)合順鉑能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。表明基因干預(yù)聯(lián)合細(xì)胞毒性藥物化療能為腫瘤的治療提供了一種新的治療手段。

NGX6基因；肺癌；順鉑；A549細(xì)胞；NCI-H1975細(xì)胞；體內(nèi)；體外

肺癌是當(dāng)前威脅人類的頭號腫瘤疾病。我國每年的肺癌新增患者超過50萬,到了2025年,這一數(shù)字將會突破100萬[1]。當(dāng)前肺癌的治療以手術(shù)為主,放化療為輔。依托泊苷和多西紫杉醇[2]與阿霉素[3],順鉑[4]等是當(dāng)前肺癌治療的常規(guī)化療藥物。然而由于化療藥物的強(qiáng)烈不良反應(yīng),且容易產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致肺癌的治療研究進(jìn)展緩慢[5]。因此需要探索新的肺癌治療手段。

基因治療是當(dāng)前腫瘤治療研究的熱點(diǎn)。NGX6基因是近年來研究發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性基因片段,它是一種腫瘤抑制基因,能夠有效的抑制腫瘤的發(fā)展[6]。有研究表明,NGX6基因能夠有效抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和結(jié)腸癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[7]。本研究旨在探討NGX6基因聯(lián)合順鉑對肺癌細(xì)胞的增殖抑制能力和對肺癌荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑制效果。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人源性A549肺癌細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 4周齡的雄性成年裸鼠50只(約20～25 g,河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,動物合格證號：2014A028；許可證號：HBYD2013-011)。動物實(shí)驗(yàn)遵循《實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)條例》。

1.3 藥品與試劑 胎牛血清(杭州四季青生物科技有限公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(2- distearoyl phosphatidylethanolamine,DSPE),2-二油?；u丙基-3-N,N,N-三甲銨(1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propane,DOTAP，美國avanti公司)；NGX6基因( Naso Phngeal carcinoma associated gene 6,北京中原公司)；1640培養(yǎng)基[賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司]；空白脂質(zhì)體(美國invitrogen公司)；魚精蛋白(碧云天生物研究所)；MTT試劑盒(美國sigma公司)；硝酸纖維素膜(Amersham Pharmacia 公司)；順鉑(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；其余試劑為分析純。

1.4 儀器 SkanIt生物發(fā)光儀(Thermo，美國)； 流式細(xì)胞分析儀(FC-500，BECKMAN COULTER，美國)；酶標(biāo)儀(Varioskan Flash，熱電，美國)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯SZ51/SZ61，日本)

1.5 方法

1.5.1 脂質(zhì)體-魚精蛋白-DNA的制備：參照Leaf Huang的方法[8-9]制備脂質(zhì)體-魚精蛋白-DNA復(fù)合物。取適量DSPE和DOTAP，用氯仿溶解,至于茄形瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機(jī)溶劑，在瓶底形成透明脂質(zhì)薄膜，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer,PBS)水化后得到空白陽離子脂質(zhì)體。將陽離子脂質(zhì)體與魚精蛋白混合孵育后得到脂質(zhì)體-魚精蛋白復(fù)合物,再加入等體積的NGX6基因共同孵育后得到載NGX6基因的脂質(zhì)體-魚精蛋白-DNA復(fù)合物(liposome protamine complexes DNA,LPD)。

1.5.2 MTT實(shí)驗(yàn)：將A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞按1500個/孔的密度接種于96孔細(xì)胞板中,在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞完全貼壁生長后,更換孔內(nèi)培養(yǎng)基,每個細(xì)胞孔加入170 μL新鮮含血清培養(yǎng)基,然后分別加入載NGX6基因的LPD(NGX6濃度為30 μg/mL)100 μL為NGX6組,順鉑注射液(3 μg/mL)100 μL為順鉑組,NGX6和順鉑各100 μL為NGX6+順鉑組,以PBS為陰性對照組。將細(xì)胞板置于37℃,5% CO2條件下孵育24,48和72 h后,吸出孔板內(nèi)液體,每孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT-PBS溶液20 μL,37 ℃、5%CO2,孵育4 h,小心吸出孔板內(nèi)液體,每孔加入200 μL DMSO溶解生成的甲臜,放置孔板于搖床中,37 ℃,75 r/min,20 min孵育,取出晾冷至常溫后,用SkanIt生物發(fā)光儀檢測各孔在490 nm處的OD值,每組設(shè)置5個復(fù)孔。

1.5.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞懸液接種于6孔板中。每組設(shè)6個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后按照1.5.2項(xiàng)下給藥培養(yǎng)24 h,棄去藥液,換新鮮培養(yǎng)基。 15 d 后甲醇固定,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞集落。計(jì)算克隆形成率和抑制率。

1.5.4 肺癌移植瘤模型的構(gòu)建：建立A549腫瘤動物模型,注射100 μL含2×106個A549細(xì)胞的PBS于小鼠背部皮下,12～14 d后,背部腫瘤直徑達(dá)到10～14 mm,可用于后續(xù)試驗(yàn)。腫瘤體積每隔2天測一次,計(jì)算公式：腫瘤體積=0.5×長軸×短軸2。小鼠體質(zhì)量每2天測一次。當(dāng)腫瘤體積到大約 100 mm3時,將小鼠分為4組,即：PBS組、NGX6組(載NGX6的LPD，NGX6濃度為30 μg/mL)、順鉑組(3 μg/mL)和LPD+順鉑組,每組10只裸鼠。統(tǒng)計(jì)各組裸鼠的腫瘤體積和生存期,裸鼠死亡后,取腫瘤組織切片,Tunel染色于光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 NGX6基因聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的增殖抑制作用 與PBS組比較各給藥組均能抑制肺癌細(xì)胞的增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各給藥組對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用具有時間依賴性,藥物對細(xì)胞增殖的抑制作用隨著時間的延長而增強(qiáng)。在相同的孵育時間下,NGX6+順鉑組對A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的增殖抑制作用顯著強(qiáng)于NGX6組和順鉑組(P<0.01)。見圖1,圖2。

圖1 NGX6基因聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的增殖抑制作用(n=5)**P<0.01,與同時間的PBS,NGX6和順鉑組比較；**P<0.01，與24 h和48 h的NGX6聯(lián)合順鉑組比較Fig.1 The inhibition rate of A549 cells and NCI-H1975 cells by NGX6 combine with cisplatin(n=5)**P<0.01，compared with PBS,NGX6 and cisplatin at the same time；# P<0.01,compared with NGX6+cisplatin at 24 h and 48 h

2.2 NGX6基因聯(lián)合順鉑對肺癌細(xì)胞克隆率的影響 NGX6組,順鉑注射液組和(NGX6+順鉑)組對A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的克隆形成均有抑制作用,與PBS組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中(NGX6+順鉑)組克隆數(shù)較NGX6組,順鉑注射液組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1、表2。

表1 各組對A549細(xì)胞克隆形成的抑制情況±s,n=6)Tab.1 Inhibition of different group on the clones of A549 ±s,n=6)

**P<0.01,與PBS組比較,compared with PBS group；#P<0.01,與NGX6組和順鉑組比較,compared with NGX6 group and cisplatin group

表2 各組對NCI-H1975細(xì)胞克隆形成的抑制情況Tab.2 Inhibition of different group on the clones of NCI-H1975 ±s,n=6)

**P<0.01,與PBS組比較,compared with PBS group；#P<0.01,與NGX6組和順鉑組比較, compared with NGX6 group and cisplatin group

2.3 NGX6基因聯(lián)合順鉑對肺癌移植瘤的生長抑制作用 截止第18天，聯(lián)合干預(yù)組對荷瘤裸鼠的腫瘤生長抑制率顯著高于NGX6基因干預(yù)組和順鉑干預(yù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；NGX6基因干預(yù)組和順鉑干預(yù)組對腫瘤生長抑制率強(qiáng)于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 不同藥物干預(yù)后腫瘤體積變化(n=10)*P<0.01，與PBS組比較；#P<0.01，與NGX6組和順鉑組比較Fig.2 The change rate of the volume of tumor with the interference of different drugs(n=10)*P<0.01，compared with PBS group; #P<0.01，compared with NGX6 group and cisplatin group

聯(lián)合干預(yù)組,NGX6基因干預(yù)組,順鉑干預(yù)組和生理鹽水組的荷瘤裸鼠的中位生存期分別為43、31、29、15d, 聯(lián)合干預(yù)組對延長荷瘤裸鼠中位生存期作用顯著強(qiáng)于NGX6基因干預(yù)組和順鉑干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與生理鹽水組比較，聯(lián)合干預(yù)組,NGX6基因干預(yù)組和順鉑干預(yù)組都能延長荷瘤裸鼠中位生存期(P<0.01)。見圖3。

圖3 不同藥物干預(yù)組荷瘤裸鼠的生存曲線Fig.3 The Kaplan-Meier curve of different group

腫瘤組織切片Tunel染色結(jié)果顯示,聯(lián)合干預(yù)組腫瘤組織出現(xiàn)大量壞死,細(xì)胞凋亡增加。見圖4。

圖4 不同藥物干預(yù)組腫瘤組織切片TUNEL染色(×200)A.PBS組；B.NGX6組；C.順鉑組；D.NGX6+順鉑組Fig.4 TUNEL staining of different tumor tissue with the interference of different drugs(×200)A.PBS group;B.NGX6 group;C.cisplatin group;D.NGX6+ cisplatin group

3 討論

肺癌是全球最普遍發(fā)生的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率居全球惡性腫瘤之首[10]。現(xiàn)在,雖然化療和放療能夠減小整個腫瘤的體積,是肺癌主要治手段,然而這種治療對于腫瘤的殺傷是非特異性的,以至于腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥性的產(chǎn)生[11]。同時當(dāng)前肺癌所采用的放療和化療較嚴(yán)重的副作用,導(dǎo)致肺癌患者生存率低,生活質(zhì)量差[12]。因此研究新的肺癌治療方法顯得十分重要。NGX6基因是近來發(fā)現(xiàn)的一組能夠抑制腫瘤發(fā)展的抑癌基因,研究表明,它在包括鼻咽癌[7],結(jié)腸癌[13]等腫瘤中表達(dá)下調(diào)。有研究顯示將NGX6基因通過質(zhì)粒或者脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后,腫瘤細(xì)胞的增殖,生長和侵襲受到抑制[14]。順鉑是目前臨床上常用的一種肺癌化療藥物,然而其常常會產(chǎn)生骨髓抑制,胃腸道反應(yīng)以及神經(jīng)毒性等副作用[15]。本研究將NGX6基因與順鉑聯(lián)合應(yīng)用于抗肺癌研究,以期為基因聯(lián)合化療治療肺癌提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究采用目前常用的LPD載體包載NGX6基因,可以避免NGX6基因被血液和組織中的核酸酶降解,能夠有效提高NGX6基因的穩(wěn)定性。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí),NGX6基因能夠有效抑制肺癌A549細(xì)胞和NCI-H1975細(xì)胞的增殖。這說明NGX6基因能夠調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖,是肺癌的抑癌基因。同時,研究發(fā)現(xiàn)NGX6基因聯(lián)合順鉑能夠增強(qiáng)對肺癌細(xì)胞的增殖抑制能力,2者具有協(xié)同作用。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)NGX6基因聯(lián)合順鉑能夠有效抑制肺癌的發(fā)展。本研究還通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),NGX6基因聯(lián)合順鉑能夠有效抑制肺癌荷瘤裸鼠腫瘤的生長,延長荷瘤裸鼠的中位生存期。

綜上所述,NGX6基因聯(lián)合順鉑對肺癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用,對裸鼠肺癌移植瘤具有高效的生長抑制作用。NGX6基因聯(lián)合順鉑是一種潛在的肺癌治療手段。

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(編校：王冬梅)

NGX6 gene combined with cisplatin in treatment of lung cancer in vitro and in vivo

ZHANG Jing1, WANG Zhe2, SHI Xiao-yu1, MENG Wei1, MA Feng1, WANG Jin3, ZHAO Yong-ming3

(1.Department of Oncology, The First Attached Hospital of Hebei Northern University, Zhangjiakou 075000, China; 2.Department of Urology, The First Attached Hospital of Hebei Northern University, Zhangjiakou 075000, China; 3.Department of Pharmacy, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

ObjectiveTo evaluate the effect of NGX6 combined with cisplatin on the inhibition rate of A549 cells and NCI-H1975 cells and antitumor effects in vivo.MethodsThe NGX6 was loaded in the LPD, and prepare Liposome protamine DNA complexes.A549 cells and NCI-H1975 cells were seperately divided into NGX6 group(30 μg/mL NGX6 concentration), cisplatin group,NGX6+cisplatin group,PBS as negative control group.The effect of cytotoxicity of four group on A549 cells and NCI-H1975 cell were evaluated by MTT assay.the clone forming rate and the inhibition rate were determined by Cell colony count.lung transplantation tumor model were successfully established, then nude mice were divided into four groups as abeve, each group of 10, tumor size and survival period were determined tumor cell apoptosis were observed.ResultsThe cell viability of A549 cells and NCI-H1975 cells of (NGX6 + cisplatin) were lower than that of NGX6 group, cisplatin group and saline group, respectively(P<0.01).The cloning efficiency of A549 cells and NCI-H1975 cells of (NGX6 + cisplatin) were lower than that of NGX6 group, cisplatin group and saline group, respectively(P<0.01).The tumor inhibitory rate was in vivo for (NGX6 + cisplatin) was higher than other group(P<0.01).The median survival of nude mice in (NGX6 + cisplatin), NGX6, cisplatin and saline group were 43,31,29 and 15 days.ConclusionNGX6 combination with cisplatin can inhibit the cell proliferate of lung cancer cells and inhibit the tumor growth and the combination of NGX6 and cisplatin may be a potentially effective treatment for lung cancer.

NGX6; lung cancer;cisplatin; A549 cells ; NCI-H1975 cells ;in vitro; in vivo

張家口市2013年度科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(1321099D)

張敬，女，碩士,主治醫(yī)師,研究方向：肺癌治療的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:zhangjingbfxy@163.com。

R734.2

A

1005-1678(2015)05-0033-04