HPLC法測(cè)定麥芽糖鐵糖漿中防腐劑的含量

焦旭雯，張雷，陳華Δ

(1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所生檢生化室，廣東 廣州 510180；2.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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HPLC法測(cè)定麥芽糖鐵糖漿中防腐劑的含量

焦旭雯1，張雷2，陳華1Δ

(1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所生檢生化室，廣東 廣州 510180；2.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 建立HPLC法測(cè)定麥芽糖鐵糖漿中防腐劑的含量。方法 采用Kromasil 100-5 C18柱，以乙腈-醋酸鹽緩沖液(40:60)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min。結(jié)果 羥苯甲酯在0.62～3.72 μg/mL、羥苯丙酯在0.18～1.07 μg/mL線性關(guān)系良好，線性方程分別為Y=228494X-2512.5、Y=203351X-3471.4；平均加樣回收率分別為100.9%(RSD=1.5%)、99.6%(RSD=0.5%)。結(jié)論 本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于麥芽糖鐵糖漿中防腐劑的測(cè)定。

麥芽糖鐵糖漿；羥苯甲酯；羥苯丙酯；含量測(cè)定

麥芽糖鐵糖漿是由瑞士Vifor Pharma公司研制的一種新型口服補(bǔ)鐵劑，其主要成分為麥芽糖鐵，此外還加有防腐劑(羥苯甲酯和羥苯丙酯)以及奶油香精等其他輔料。它能有效地提高輕到中度缺鐵性貧血患者的血紅蛋白(hemoglobin，HB)和血清鐵蛋白濃度，用于治療無(wú)貧血鐵缺乏和缺鐵性貧血[1]，目前已在全球80多個(gè)國(guó)家上市銷(xiāo)售，在我國(guó)目前還沒(méi)有獲準(zhǔn)上市。糖漿劑內(nèi)含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于微生物的滋生與繁殖，防腐劑作為處方中的關(guān)鍵組成部分之一，其正確合理使用與否，直接關(guān)系到藥品的質(zhì)量[2]。防腐劑按其性質(zhì)可分為酸性、中性、季胺鹽和有機(jī)汞等4類(lèi)，其中羥苯酯類(lèi)使用最為廣泛。口服含羥苯酯類(lèi)的藥品一般不會(huì)產(chǎn)生Ⅳ型遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)，但少數(shù)特異質(zhì)患者仍會(huì)出現(xiàn)全身性接觸性皮炎癥狀，表現(xiàn)為全身濕疹樣病變。一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)把14例對(duì)羥苯酯類(lèi)過(guò)敏的患者分成安慰劑組和口服含羥苯酯類(lèi)膠囊組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅2例呈陽(yáng)性反應(yīng)[3]。國(guó)內(nèi)未見(jiàn)本品防腐劑含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道，故本文建立測(cè)定麥芽糖鐵糖漿中羥苯甲酯和羥苯丙酯含量的方法，旨在更好的控制本品質(zhì)量，保證臨床用藥安全。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Waters Empower 2487/2695高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Sartorius CPA225D電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

1.1.2 藥品與試劑：羥苯甲酯鈉對(duì)照品(批號(hào)：100719-200701；含量：98.1%)、羥苯丙酯對(duì)照品(批號(hào)：100444-201102；含量：99.6%)，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈(色譜純，Honeywell，批號(hào)：NBLA1H，含量≥99.99%)；奶油香精(瑞士VIFOR公司)；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱：Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相為乙腈-醋酸鹽緩沖液(稱(chēng)取醋酸鈉三水合物680 mg至1000 mL水中，用醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.4)(40︰60)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為40 μL。

1.2.2 溶液的制備

① 系統(tǒng)適用性溶液：稱(chēng)取奶油香精約100 mg，置于10 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，量取上述溶液0.8 mL，再分別量取羥苯甲酯鈉、羥苯丙酯對(duì)照貯備液(見(jiàn)“②”)270 μL、30 μL，置于同一10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得。

② 對(duì)照品溶液：分別精密稱(chēng)取羥苯甲酯鈉、羥苯丙酯0.01447 g、0.01433 g，分別置50 mL量瓶中，加乙醇溶解并制成每1 mL中約含羥苯甲酯鈉0.29 mg和羥苯丙酯0.28 mg的混合溶液，作為羥苯甲酯鈉、羥苯丙酯對(duì)照貯備液；分別精密量取上述對(duì)照貯備液 1 mL、 0.25 mL，置于同一10 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照貯備液。精密量取混合對(duì)照貯備液 1 mL， 置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得。

③ 供試品溶液：取麥芽糖鐵糖漿1 mL，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得。

分別量取系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液 40 μL， 按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 線性試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照貯備液適量，分別置不同體積的量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，制成濃度為每mL含0.62、1.24、1.86、2.48、3.72 μg的羥苯甲酯對(duì)照品溶液，0.18、0.36、0.54、0.71、1.07 μg的羥苯丙酯對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.2.4 精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件，在10 ℃分別于0、1、4、8、12、24 h進(jìn)樣40 μL，測(cè)定峰面積。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批(批號(hào)：426001)樣品6份，分別按“1.2.2”項(xiàng)下③方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的供試品(批號(hào)：426001，羥苯甲酯：0.615 mg/mL，羥苯丙酯：0.170 mg/mL)1 mL，置25 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品貯備液；分別取對(duì)照品溶液0.3、0.5和0.6 mL，各置10 mL量瓶中，分別加入供試品貯備液0.5 mL，加流動(dòng)相定容，搖勻，制成60%、100%和120%的低、中、高濃度溶液，每個(gè)濃度平行3份。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。

1.2.8 樣品測(cè)定：取3批樣品，按照供試品溶液配制方法制備，分別采用按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜柱(色譜柱1#)及Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?)色譜柱(色譜柱2#)，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積分別計(jì)算羥苯甲酯、羥苯丙酯的含量。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 羥苯甲酯與奶油香精2個(gè)色譜峰的分離度分別為5.9、6.9，分離效果較好。見(jiàn)圖1。

圖1 各溶液HPLC色譜圖Fig.1 HPLC Chromatogram of each solution

2.2 線性試驗(yàn) 以各組分濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：羥苯甲酯：Y=228494X-2512.5，r=1.000(n=5)；羥苯丙酯：Y=203351X-3471.4，r=1.000(n=5)。結(jié)果表明，羥苯甲酯在0.62～3.72 μg/mL，羥苯丙酯在0.18～1.07 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn) 羥苯甲酯及羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.10%及0.22%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 羥苯甲酯及羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.21%及0.38%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 測(cè)得羥苯甲酯平均含量為0.61 mg/mL，RSD=0.51%；羥苯丙酯平均含量為0.17 mg/mL，RSD=0.62%。

2.6 回收率試驗(yàn) 羥苯甲酯、羥苯丙酯的加樣回收率分別為100.89%，RSD值為1.5%、99.59%，RSD值為0.5%。結(jié)果表明該方法有良好的回收率。見(jiàn)表1。

表1 回收率計(jì)算結(jié)果(n=9)

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果 采用Kromasil 100-5 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱與Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，300 ?)色譜柱測(cè)定結(jié)果基本一致。見(jiàn)表2。

表2 樣品防腐劑含量測(cè)定結(jié)果(mg/mL，n=2)Tab.2 Determination and robustness results of preservative in samples (mg/mL，n=2)

3 討論

3.1 色譜條件選擇 本文參考大多數(shù)文獻(xiàn)[4-9]使用C18色譜柱進(jìn)行考察，經(jīng)DAD光譜掃描，確定254 nm為羥苯甲酯和羥苯丙酯的測(cè)定波長(zhǎng)。由于處方中添加的奶油香精有紫外吸收，且在羥苯甲酯前后各有一色譜峰，其與羥苯甲酯的分離度成為主要考察目標(biāo)。本文采用的流動(dòng)相為乙腈-醋酸鹽緩沖液(pH4.4)(40︰60)，在此色譜條件下，基線穩(wěn)定，羥苯甲酯與奶油香精2個(gè)色譜峰的分離度分別為5.9、6.9，且與羥苯丙酯也能很好分離；羥苯甲酯和羥苯丙酯的理論塔板數(shù)均大于7000，峰形對(duì)稱(chēng)。

3.2 樣品處理方式 羥苯酯類(lèi)防腐劑易溶于乙醇，通過(guò)預(yù)配一定濃度的乙醇溶液，再與水混合，有利于防腐劑的快速分散與溶解，因此選取乙醇作為第一步稀釋的溶劑，能夠較好的將待測(cè)組分溶解。然而主成分麥芽糖鐵在醇中易析出，生成棕色沉淀，即游離鐵，樣品二步稀釋之前，應(yīng)先離心，再濾過(guò)，取續(xù)濾液?？紤]羥苯酯類(lèi)防腐劑在pH值4～8時(shí)有效，隨著pH值升高，形成的苯酚基陰離子會(huì)導(dǎo)致活性降低[11]，故選擇流動(dòng)相作為其二步稀釋溶劑較為合適。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)討論 ICH明確提出應(yīng)制定防腐劑含量測(cè)定方法，但目前我國(guó)藥品研發(fā)過(guò)程中一般很少對(duì)防腐劑進(jìn)行質(zhì)量控制，由此容易導(dǎo)致部分企業(yè)在防腐劑的使用上缺乏嚴(yán)格的管理[12]?！吨袊?guó)藥典》2015年版四部[13]規(guī)定，糖漿劑中羥苯酯類(lèi)的用量不得超過(guò)0.05%，考慮本品用量偏大，建議企業(yè)結(jié)合其抗菌防腐效力，適當(dāng)降低此類(lèi)防腐劑含量，同時(shí)確保藥品在有效期內(nèi)的微生物指標(biāo)合格。本方法在測(cè)定麥芽糖鐵糖漿防腐劑含量時(shí)，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，對(duì)于企業(yè)提升產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，降低質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)具有一定意義，同時(shí)為該品種仿制藥研發(fā)防腐劑處方設(shè)計(jì)提供了參考依據(jù)。

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(編校：王冬梅)

Determination of preservative in iron maltose syrup by HPLC

JIAO Xu-wen1, ZHANG Lei2, CHEN Hua1Δ

(1.Health Inspection Biochemical Laboratory,Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China; 2.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of preservative in iron maltose syrup.MethodsA Kromasil 100-5 C18column was used with acetonitrile- sodium acetate buffer solution(40︰60) as the mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min and 254 nm as the detection wavelength.The column temperature was set at 30 ℃.ResultsThe calibration curve was linear within the range of 0.62～3.72 μg/mL for methyl parahydroxybenzoate, 0.18～1.07 μg/mL for propyl parahydroxybenzoate, and the linear equation wasY=228494X-2512.5,Y=203351X-3471.4, respectively.The average recovery of methyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate was 100.9%(RSD=1.5%),99.6%(RSD=0.5%), respectively.ConclusionThe established method is simple, rapid and accurate, which could be used in the determination of preservative in iron maltose syrup.

iron maltose syrup; methyl parahydroxybenzoate; propyl parahydroxybenzoate; determination

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B0402000029)

焦旭雯，女，碩士，主管藥師，研究方向：生化藥品檢驗(yàn)，E-mail：jjxxww17@163.com；陳華，通信作者，女，碩士，副主任藥師，研究方向：生化藥品及生物制品質(zhì)量控制，E-mail：gdchenhua@sina.com。

R917

A

1005-1678(2015)11-0169-03