反相高效液相色譜法測(cè)定舒肺合劑中甘草酸銨的含量

吳雪丹，計(jì)燕萍，杜靜，傅應(yīng)華Δ

(1.象山縣第一人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 象山 315700；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江 嘉興 314001；3. 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310009)

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反相高效液相色譜法測(cè)定舒肺合劑中甘草酸銨的含量

吳雪丹1，計(jì)燕萍2，杜靜3，傅應(yīng)華2Δ

(1.象山縣第一人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 象山 315700；2.嘉興學(xué)院 醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，浙江 嘉興 314001；3. 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院 藥劑科，浙江 杭州 310009)

目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定舒肺合劑中甘草酸銨含量的方法。方法 以Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)為色譜柱，乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉液-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀液(20:45:45) (用20%氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.05)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。結(jié)果 甘草酸銨與相鄰組分峰分離良好，陰性樣品無干擾。甘草酸銨濃度在23.6～118.1 μg /mL之間與峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程Y=0.1133X-0.00110，r=0.999 8，加樣回收率(n=6 )為97.8%，RSD=0.88%。3批舒肺合劑樣品測(cè)定甘草酸銨含量范圍在0.2532～0.2865 mg/mL之間，平均為0.2721 mg/mL。結(jié)論 本法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可作為舒肺合劑的含量測(cè)定方法。

反相高效液相色譜法；甘草酸銨；舒肺合劑；含量測(cè)定

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種全身系統(tǒng)受損的自身免疫性疾病，因體內(nèi)有大量致病性自身抗體和免疫復(fù)合物而造成組織損傷[1]，目前尚無專用于治療“紅斑狼瘡”的有效藥物。杭州市紅十會(huì)醫(yī)院(浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)一直致力于從肺論治降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡抗菌藥物用量的臨床研究課題，自2002年開始，擬定了療效確切、毒副作用小、純中藥的潤(rùn)肺和舒肺醫(yī)院協(xié)定處方，結(jié)合化學(xué)藥對(duì)SLE患者進(jìn)行治療，在減少疾病復(fù)發(fā)、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的毒副作用及降低SLE患者感染發(fā)生率方面取得很好的療效。舒肺合劑處方由桂枝、桔梗、甘草、天花粉等6味中藥組成，對(duì)治療活動(dòng)期的SLE患者，以清透肺熱為主，輔以涼血解毒功能[2]。由于原制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測(cè)定項(xiàng)目，為了提高本品質(zhì)量，需要增訂含量測(cè)定項(xiàng)目。本文依據(jù)該制劑的組方特點(diǎn)，方中甘草是君藥之一，甘草酸銨是甘草中含量較高的有效成份[3]，可用甘草酸銨作為質(zhì)控指標(biāo)。有關(guān)甘草酸銨的含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[4-11]。本文研究擬建立反相高效液相色譜法測(cè)定舒肺合劑中甘草酸銨含量的方法，以期為甘草酸銨含量測(cè)定的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀由P680四元低壓梯度泵、UVD170U紫外-可見檢測(cè)器、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站組成(美國Dionex公司)；XS105DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)；USC502型超聲波清洗器(上海波龍電子設(shè)備有限公司，工作頻率：56 kHz，功率160 W)；Mili-Q超純水器(美國密理搏公司)。

甘草酸銨對(duì)照品(批號(hào)：110731-201317，供含量測(cè)定用，含量92.6%)，購自中國食品藥品檢定研究院；舒肺合劑三批(自制)，規(guī)格500 mL(每100 mL相當(dāng)于甘草3 g)，批號(hào)分別為20150121，20150122，20150123；缺甘草的陰性樣品一批(自制)，批號(hào)：20150121；乙腈為色譜純(德國Merck公司)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純，水為超純水。

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Zarbox SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉液-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀液(20:45:45) (用20%氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.05)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液：精密稱取甘草酸銨對(duì)照品11.02 mg，置20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成50.0 μg/mL甘草酸銨對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液：取本品，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇15 mL，超聲處理10 min，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，初濾，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 缺甘草的陰性樣品溶液：取缺甘草的陰性樣品約5 mL，同法制備缺甘草的陰性樣品溶液。

1.4 測(cè)定條件的選擇

1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)：取甘草酸銨對(duì)照品適量，用流動(dòng)相制成15 μg/mL溶液，于UV-2501紫外分光光度計(jì)上在300～200 nm之間作波長(zhǎng)掃描。

1.4.2 樣品提取條件：

① 提取溶劑考察：舒肺合劑是采用傳統(tǒng)水煎煮方式提取，水溶性雜質(zhì)較多，選用甲醇、乙醇作溶劑，對(duì)除雜質(zhì)效果進(jìn)行了考察；

② 甲醇量考察：由于本品為液體制劑，提取時(shí)甲醇濃度會(huì)影響甘草酸銨的含量及除去水溶性雜質(zhì)的效果。精密量取本品5 mL，共3份，置25 mL量瓶中，分別加入甲醇10、15、20 mL，超聲處理10 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，濾液澄清，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定含量；

③ 超聲處理時(shí)間考察：精密量取本品5 mL，精密稱定，共3份，置25 mL量瓶中，各加甲醇15 mL，分別超聲處理5、10、20 min，取出，放冷，加甲醇至該度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定含量；

④ 專屬性試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺甘草的陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 精密度試驗(yàn)：取對(duì)照品溶液(甘草酸銨濃度為50.0 μg/mL)10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次檢測(cè)峰面積。

1.5.2 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品(批號(hào)：20150121)，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液5份，按本文給定的色譜條件測(cè)定甘草酸銨的含量。

1.5.3 線性關(guān)系試驗(yàn)：精密稱取甘草酸銨對(duì)照品8.50 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取0.3，0.5，0.7，1.0，1.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。各精密量取10 μL，注入液相色譜儀，每個(gè)濃度進(jìn)樣2次，測(cè)定平均峰面積。以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，甘草酸銨對(duì)照品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下同一批供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、24 h，精密量取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定甘草酸銨峰面積。

1.5.5 加樣回收率試驗(yàn)：精密量取已知含量的舒肺合劑(批號(hào)20150121，甘草酸銨平均含量為0.2765 mg/mL)5 mL，置50 mL量瓶中，共6份，各精密加入甘草酸銨對(duì)照品甲醇溶液(含甘草酸銨1.3881 mg/mL)1 mL，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“1.5.6”項(xiàng)下方法測(cè)定甘草酸銨含量，計(jì)算回收率。

1.5.6 樣品測(cè)定：取樣品3批，按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶的液，按本文給定的色譜條件測(cè)定；另取“1.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液同法測(cè)定作對(duì)照，計(jì)算樣品中甘草酸銨含量。每批樣品測(cè)定5次。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)：最大吸收波長(zhǎng)為250 nm，故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

2.1.2 樣品提取條件：①提取溶劑：用甲醇作溶劑，去雜質(zhì)效果佳，溶液易濾過，濾液澄清，故選用甲醇作溶劑；

② 甲醇量：加甲醇15～20 mL，甘草酸銨含量不變，故選定加甲醇15 mL；

③ 超聲處理時(shí)間：超聲處理10～20 min時(shí)甘草酸銨含量不變，故選定超聲時(shí)間為10 min；

④ 專屬性：對(duì)照品溶液中甘草酸銨保留時(shí)間為9.736 min，峰形對(duì)稱；供試品溶液中甘草酸銨與其它組分峰分離良好，分離度R>1.5，理論板數(shù)為2647；缺甘草的陰性樣品溶液在與甘草酸銨保留時(shí)間相同處無出現(xiàn)干擾峰，表明專屬性好。見圖1。

圖1 舒肺合劑的HPLC色譜圖A.甘草酸銨對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液；1.甘草酸銨Fig.1 HPLC chromatogram of Shufei MixtureA.ammonium glycyrrhizinate standard solution；B. sample solution；C. negative solution；1.ammonium glycyrrhizinate

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 精密度試驗(yàn)：峰面積的RSD= 1.01%(n=6)，表明精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)：5次測(cè)定甘草酸銨含量分別為0.2755、0.2778、0.2740、0.2785、0.2766 mg/mL，得含量的RSD =0.65%(n= 5 )，表明重復(fù)性良好。

2.2.3 線性關(guān)系試驗(yàn)：線性回歸方程為Y=0.1133X-0.00110，r=0.999 8。結(jié)果表明：甘草酸銨在23.6～118.1 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：6次測(cè)定甘草酸銨峰面積的RSD=0.65%，表明樣品溶液在配制后24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5加樣回收率試驗(yàn)：平均回收率為97.8%，RSD=0.88%。見表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)Tab.1 Result of average recovery(n=6)

2.2.6 樣品測(cè)定： 3批樣品中甘草酸銨的平均含量為0.2721 mg/mL。見表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (n=5)Tab.2 Result of sample determination(n=5)

3 討論

曾試驗(yàn)用甲醇-水作流動(dòng)相，甘草酸銨保留時(shí)間過長(zhǎng)，柱效低；改用乙腈-水作流動(dòng)相，可縮短甘草酸銨的保留時(shí)間，但對(duì)舒肺合劑中甘草酸銨與其他組分的分離效果較差，其中有一較大峰較難分離。采用庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑以增加甘草酸銨在乙腈-水流動(dòng)相中的保留時(shí)間，同時(shí)為了提高甘草酸銨的柱效和峰形對(duì)稱性，添加了磷酸二氫鉀。比較不同濃度庚烷磺酸鈉、磷酸二氫鉀及流動(dòng)相的pH值對(duì)甘草酸銨與相鄰雜質(zhì)峰的分離，通過調(diào)節(jié)有機(jī)相與水的比例以達(dá)到甘草酸銨峰形對(duì)稱、保留時(shí)間適中，柱效高并與相鄰峰完全分離的目的。確定的最佳流動(dòng)相條件為乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸鈉液-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀液(20:45:45)(用20%氫氧化鈉液調(diào)節(jié)pH值為7.2±0.05)。同時(shí)比較了Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×15 cm，5 μm)、Extend-C18柱(4.6 mm×15 cm，5 μm)和ZARBOX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)3種不同色譜柱。試驗(yàn)結(jié)果以Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)為佳。在給定的色譜條件下，一次進(jìn)樣在32 min內(nèi)出峰完畢，定量準(zhǔn)確性和進(jìn)樣精密度均好。

3批舒肺合劑樣品測(cè)定甘草酸銨含量范圍在0.2532～0.2865 mg/mL之間，平均為0.2721 mg/mL。考慮到不同產(chǎn)地甘草中甘草酸銨含量有差異以及貯存期含量的變化等因素，在制定舒肺合劑標(biāo)準(zhǔn)時(shí)甘草酸銨最低含量擬控制在平均值的80%，即甘草酸銨含量不得低于0.22 mg/mL。

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(編校：王儼儼)

Determination of ammonium glycyrrhizinate in Shufei Mixture by RP-HPLC

WU Xue-dan1, JI Yan-ping2, DU Jing3, FU Ying-hua2Δ

(1.Department of Pharmacy, First People’s Hospital of Xiangshan County, Xiangshan 315700, China; 2. Department of Pharmacy, College of Medicine, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China; 3. Department of Pharmacy, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for determination of ammonium glycyrrhizinate in Shufei Mixture.MethodsThe sample was analyzed on an Agilent Zorbax SB-C18column (4.6mm×150 mm, 5 μm), and acetonitrile-0.0025 mol/L sodium heptanesulfonate solution-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution(20:45:45) (adjusted pH value of 7.2±0.05 with 20% sodium hydroxide solution)was used as mobile phase. The flow rate was at 1.0 mL/min. The detective wavelength was at 250 nm. The column temperature was 30 ℃.ResultsWith this chromatographic condition, the ammonium glycyrrhizinate peak in Shufei Mixture sample chromatogram could be separated with other ingredient peaks completely. The negative sample had no interference. The calibration curve was linear at a ranges of 23.6-118.1 μg/mL for ammonium glycyrrhizinate, and equation of regression wasY=0.1133X-0.00110，r=0.999 8. The average recovery from sample was 97.8% and RSD was 0.88%(n=6). The content range of ammonium glycyrrhizinate in three batch Shufei Mixture sample was 0.2532-0.2865 mg/mL, and average content was 0.2721 mg/mL.ConclusionThis method is simple, accurate, and useful for control method of this preparation.

RP-HPLC; ammonium glycyrrhizinate; Shufei Mixture; content determination

吳雪丹，女，本科，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，E-mail：lwphxd@126.com；傅應(yīng)華，通信作者，女，本科，教授，研究方向：藥物制劑與質(zhì)量控制，E-mail：yaoji6217@sohu.com。

R917

A

1005-1678(2015)11-0175-03