楊梅,王瑩,趙忠熙Δ
(1.山東大學 藥學院,山東 濟南 250100;2.山東省紅棗食藥工程技術研究中心,山東 濟南 250012)
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新型樂陵金絲小棗原汁中的生物活性成分分析
楊梅1,2,王瑩1,2,趙忠熙1,2Δ
(1.山東大學 藥學院,山東 濟南 250100;2.山東省紅棗食藥工程技術研究中心,山東 濟南 250012)
目的 對新型樂陵金絲小棗原汁中所含主要生物活性成分進行檢測。方法 原汁中游離單糖和水溶性多糖的分析,分別采用了高效液相色譜-示差折光檢測法(HPLC-RID)法以及苯酚-硫酸法衍生化后紫外分光光度法來測定,氨基酸和礦物質的含量分別使用氨基酸自動分析儀法和原子吸收光譜法來分析,總酚和總黃酮的定量首先分別通過與福林酚和硝酸鋁形成絡合物后經(jīng)紫外分光光度法來檢測,蘆丁和環(huán)核苷酸的分析利用了HPLC法。結果 樂陵金絲小棗原汁中蔗糖、葡萄糖、果糖和多糖平均含量分別為3.9、32.5、27.3和3.6 mg/mL;氨基酸總量平均值為269.7 μg/mL;礦物質Ca、Fe、Mg、Zn、Mn、Cr、Cu的平均含量分別為35.1、0.85、55.8、0.85、0.44、0.41、0.21 μg/mL;總酚(以沒食子酸計)、總黃酮(以蘆丁計)、蘆丁、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)平均含量分別為1.34、157.3、7.15、19.2和8.11 μg/mL。結論 該新型樂陵金絲小棗原汁中含有豐富的營養(yǎng)成分,值得進一步開發(fā)推廣。
金絲小棗原汁;游離糖;多糖;氨基酸;礦物質;黃酮;多酚;環(huán)核苷酸
棗(ZiziphusjujubaMill.)隸屬于鼠李科棗屬,主要分布于亞洲和北美洲的亞熱帶和熱帶地區(qū)。棗果中營養(yǎng)成分豐富,主要包含碳水化合物、氨基酸、礦物質、多酚、黃酮、環(huán)核苷酸、維生素、三萜類等活性物質,是傳統(tǒng)的藥食兼用佳品[1]。
紅棗有效成分藥理實驗研究證實,棗果在抗腫瘤、降血壓、降血脂、保護肝臟、健脾養(yǎng)胃等方面有顯著的療效。另外,還具有補血養(yǎng)顏、增強免疫力、抗衰老、補腦養(yǎng)神等多種功效[2],所以其高端功能食品和藥品開發(fā)利用近幾年受到了國內外的廣泛關注。
山東省德州地區(qū)是樂陵金絲小棗的發(fā)祥地,樂陵金絲小棗栽培歷史悠久,風味甘美,營養(yǎng)豐富,曾作為封建王朝的貢品,現(xiàn)暢銷國內和東南亞、日本、美國等地,與肥城佛桃、萊陽茌梨并稱為山東省的三大名果[3]。為了深入挖掘樂陵金絲小棗的食用和藥用價值,本研究選用了產(chǎn)于樂陵市的新型金德潤牌樂陵金絲小棗原汁作為分析對象,對其進行了主要生物活性成分的評價,以期為金絲小棗中高端產(chǎn)品的開發(fā)提供生物成分物質基礎方面的實驗數(shù)據(jù)。
1.1 材料
1.1.1 試材:金德潤牌樂陵金絲小棗原汁購自樂陵市德潤健康食品有限公司。
1.1.2 試劑與儀器:環(huán)磷酸腺苷(cAMP),環(huán)磷酸鳥苷(cGMP),蘆丁,沒食子酸,葡蔗糖,蔗糖,果糖,以上均為色譜純標準品;亞硝酸鈉,九水合硝酸鋁,氫氧化鈉,無水碳酸鈉,二水合檸檬酸鈉,苯酚,福林-酚試劑,濃硫酸,磷酸,無水乙醇均為分析純;濃鹽酸,硝酸,高氯酸均為優(yōu)級純;磷酸二氫鉀,甲醇為色譜純。
Agilent 1260高校液相色譜儀,日立L-2000高效液相色譜儀,日立-835型氨基酸自動分析儀,M-3100型原子吸收分光光度計(美國PE公司),DK-420S三用恒溫水箱(精宏實驗設備有限公司),DH07-9076A型恒溫箱(上海精宏實驗設備有限公司),MZH300T1型恒溫加熱真空干燥器(北京綠野創(chuàng)能機電設備有限公司),SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司),MDF-U53V型醫(yī)用低溫箱(三洋電機株式會社),TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(北京普析),Master-Q plus超純水機(上海和泰儀器有限公司),RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀(菏澤市鑫源儀器儀表有限公司),KQ-500db型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 糖類成分的含量測定:
① 多糖的含量測定(苯酚-硫酸法):葡萄糖標準曲線的制作[4]:精密稱取葡萄糖對照品40.00 mg,置于100 mL容量瓶中,超純水定容,配成400 μg/mL的儲備液。分別精密吸取儲備液0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60、1.80 mL置于具塞試管中,加超純水至2 mL,另取2 mL超純水作空白對照,然后各加1.00 mL的6%苯酚溶液及5.00 mL濃硫酸,靜置10 min,搖勻后室溫下靜置20 min,冷卻后于490 nm波長處以空白對照溶液為參比,測定吸光值,測3次取平均值。以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線。
樣品溶液的測定:300 mL棗汁旋蒸除去水至浸膏狀,加入100 mL無水乙醇,70 ℃超聲提取1 h,重復提取3次,除去醇溶性物質,濾渣加入100 mL超純水完全溶解,加入無水乙醇調至80%乙醇,4 ℃ 醇沉24 h。抽濾得到多糖沉淀(濾液待用),用超純水溶解并定容至100 mL,得到多糖樣品溶液。精密吸取上述樣品溶液 30 μL于具塞試管中,按照上述方法測定吸光值,在標準曲線上查出相應的多糖濃度,計算棗汁中的多糖含量,平行測定3次。
② 游離糖的含量測定[高效液相色譜-示差折光檢測法(reversed phase high performance liquid chromatography,HPLC-RID)]
標準溶液的配制:單標液的配制:精確稱取葡萄糖、果糖、蔗糖標準品各2.0 g,分別用超純水溶解定容至100 ml,配制成20 mg/mL的標準溶液。分別精密吸取上述葡萄糖標準溶液和果糖標準溶液0.5、1、2.5、5 mL于10 mL容量瓶中,超純水定容,配制成濃度為1、2、5、10 、20 mg/mL的系列標準溶液。精密吸取20 mg/mL蔗糖標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于10 mL容量瓶中,超純水定容,配制成蔗糖濃度為200、400、600、800、1000 μg/mL的系列標準溶液。以上標準溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,待測?;鞓艘旱呐渲疲壕_稱取葡萄糖、果糖、蔗糖標準品各2.0 g,超純水溶解定容至100 mL,配制成葡萄糖、果糖、蔗糖濃度均為20 mg/mL的混合標準液,精密吸取該混標液2.5 mL于10 mL容量瓶中,超純水定容,配制成各成分均為5 mg/mL的混標液,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,待測。
樣品溶液的配制:1.2.1項下醇沉后過濾多糖得到的濾液所含即為棗汁中的游離糖,將該濾液旋蒸至盡干,超純水溶解定容至100 mL。取上述溶液1 mL,超純水稀釋至50 mL,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,平行測定3次。
色譜條件:色譜柱:美國Bio-Rad伯樂Aminex HPX-87H糖分析柱(300 mm×7.8 mm);流動相:5 mmol硫酸;流速:0.5 mL/min;進樣量:10 μL; 柱溫:45 ℃;檢測器:示差折光檢測器(RID)。
1.2.2 氨基酸的含量測定[4-8]:
① 溶液的配制:水解液:6 N HCl溶液,5 N NaOH(含5%SnCl2)溶液;稀釋液(pH 2.2的檸檬酸鈉緩沖液):稱取1.96 g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2 H2O)和1.65 mL濃鹽酸加水稀釋到100 mL,調節(jié)pH至2.2。
② 樣品的測定:取5 mL紅棗原汁于水解管中,加5 mL 6N HCl水解液后將水解管放入冷凍劑中,冷凍5 min,再接通真空泵抽真空,然后充入高純氮氣;再抽真空充氮氣,重復3次后封口,于105 ℃水解24 h。取出冷卻至室溫,打開水解管,用超純水多次沖洗水解管,將水解液全部轉移到50 mL容量瓶內并用超純水定容。充分溶解后取2.0 mL于容量瓶中,用真空干燥器在50 ℃干燥,殘留物用2 mL超純水溶解,再干燥,重復操作3次后準確加入2.0 mL稀釋液,充分溶解,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。將上述濾液50 μL輸入氨基酸自動分析儀中進行測定,重復測定3次。食物中蛋白質在酸水解過程中,其色氨酸極易被分解,所以采用堿水解方法來測定色氨酸含量:取5 mL紅棗原汁于水解管中,加5 mL 6N NaOH(含5%SnCl2)水解液后將水解管放入冷凍劑中,冷凍5 min,再接通真空泵抽真空,然后充入高純氮氣;再抽真空充氮氣,重復3次后封口,于105 ℃水解24 h。取出冷卻至室溫,打開水解管,用超純水多次沖洗水解管,將水解液全部轉移到燒杯內,在冰浴中加入6N HCl 調pH至7,然后轉移至50 mL容量瓶內并用超純水定容,搖勻后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。將上述濾液50 μL輸入氨基酸自動分析儀中進行測定,重復測定3次。將樣品測定譜圖與已知混合氨基酸標準譜圖核對,根據(jù)已知濃度標準樣的峰面積與譜圖峰面積的比,計算出棗汁中各氨基酸的濃度。
1.2.3 礦物質的含量測定[6-9]:量取20 mL棗汁置入100 mL燒杯中,加入2 mL HClO4,蓋上表面皿,靜置2 h后加入8 mL HNO3,蓋上表面皿,電爐加熱消化,至溶液無色透明,繼續(xù)加熱至盡干,冷卻后用去離子水溶解并轉移至25 mL容量瓶,定容,混勻,采用原子吸收分光光度計進行測定(測定時根據(jù)需要進行稀釋),每個樣品重復測定3次。
1.2.4 總酚含量測定(福林-酚法)[10]:
① 沒食子酸標準曲線的制作:精密稱取沒食子酸標準品20 mg,超純水溶解定容至10 mL,配制成2 mg/mL沒食子酸標準溶液。分別準確吸取上述標準溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于10 mL刻度比色管中,分別向各比色管中加入0.5 mL福林酚試劑,室溫放置5 min,再向比色管中加入1.5 mL 20%碳酸鈉溶液,完全混勻后,加超純水至 10 mL,75 ℃水浴10 min,于760 nm處測定其吸光值,測3次取平均值。以沒食子酸濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制沒食子酸標準曲線。
② 樣品溶液中總酚含量的測定:精密吸取紅棗原汁0.5 mL 于10 mL刻度比色管中,按1.2.4下①中方法測定吸光度,按標準曲線方程計算棗汁中總酚的含量。
1.2.5 黃酮類的含量測定:
① 總黃酮含量測定(硝酸鋁法):蘆丁標準曲線的制作:精密稱取蘆丁標準品20 mg,以50:50甲醇-水溶液溶解并定容至100 mL,得到0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液。分別準確吸取 0.2 mg/mL蘆丁對照品溶液 0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mL于10 mL刻度比色管中,分別向各個比色管中加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉溶液,混合均勻,室溫放置6 min,再向比色管中加入 0.3 mL 10%硝酸鋁溶液,混合均勻,室溫放置6 min,最后向比色管中加入4.0 mL 10%氫氧化鈉溶液,加超純水至10 mL,搖勻,繼續(xù)放置15 min,于510 nm處測定其吸光值,測3次取平均值。以蘆丁濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制蘆丁標準曲線。
樣品溶液中黃酮含量的測定:300 mL棗汁旋蒸至浸膏后,加入50 mL 60%乙醇70 ℃超聲提取1 h,重復提取3次。合并3次濾液旋蒸至盡干,用50:50甲醇-水定容至100 mL,制備成樣品溶液。取上述樣品溶液1 mL,用50:50甲醇-水溶液稀釋至10 mL。精密吸取稀釋后的樣品溶液5.0 mL 于10 mL刻度比色管中,按上述方法測定吸光度,按標準曲線方程計算棗汁中總黃酮的含量。
② 蘆丁含量的測定(HPLC-UV法):標準溶液的配制:精密稱取10 mg蘆丁標準品,甲醇溶解定容至10 mL,配制成2 mg/mL的儲備液。分別吸取儲備液25、50、100、250、500、1000 μL于10 mL容量瓶中,甲醇定容。配制成濃度分別為5、10、20、50、100、200 μg/mL的系列標準溶液,經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,待測。
樣品溶液的配制:取1.2.5①中制備的樣品溶液,經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,重復測定3次。
色譜條件[11]:色譜柱:Phenomenex Luna C18(4.6 mm×15 mm ,5 μm);流動相:50:50:0.05%:甲醇-水-磷酸;流速:0.8 mL/min;進樣體積:20 μL 柱溫:30 ℃;檢測波長:360 nm。
1.2.6 環(huán)磷酸苷的含量測定(HPLC-UV法):
① 標準溶液的配制:混標液的配制:精確稱取cAMP、cGMP準品各10 mg,超純水溶解定容至10 mL,配制成 cAMP、cGMP 濃度均為10 mg/mL的混合標準液,分別精密吸取上述混標液50、100、200、500、1000、2000 μL于10 mL容量瓶中,超純水定容。配制成濃度分別為5、10、20、50、100、200 μg/mL 的系列混標液,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,待測。
單標液的配制:精確稱取cAMP和cGMP 10 mg,分別用超純水溶解定容至10 mL,稀釋成100 μg/mL的標準溶液,經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾,待測。
② 樣品溶液的配制:新型樂陵金絲小棗原汁,經(jīng) 0.45 μm濾膜過濾,重復測定3次。
③ 色譜條件[12]:色譜柱:phenomenex luna C18(4.6 mm×15 mm,5 μm);流動相:20 mmol KH2PO4-甲醇:90:10;流速:1.0 mL/min;進樣體積:20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長:254 nm。
2.1 金絲小棗原汁中常規(guī)營養(yǎng)成分的組成及含量
2.1.1 金絲小棗原汁中糖類的組成及含量:實驗得到游離糖和多糖標準曲線相應回歸方程及相關系數(shù)(表1)和游離糖分離色譜圖(圖1)。計算得到金絲小棗原汁中蔗糖、果糖、葡萄糖和多糖平均含量分別為3.85、27.3、32.5、3.6 mg/mL(n=3)。
表1 糖類的回歸方程和相關系數(shù)
圖1 游離單糖對照品(A)和樣品溶液(B)的HPLC色譜圖1.蔗糖 2.葡萄糖 3.果糖Fig.1 HPLC chromatograms of free sugar standard (A)and sample solutions (B)1. sucrose 2. glucose 3. fructose
2.1.2 紅棗原汁中氨基酸組成及含量:采用氨基酸自動分析儀法檢測到了紅棗原汁中的15種氨基酸,檢測結果見表2。氨基酸總量平均值為269.7 μg/mL,其中脯氨酸平均含量最高。
表2 金絲小棗原汁中氨基酸的平均含量(n=3)Tab.2 Amino acid average contents in the jujube juice(n=3)
2.1.3 紅棗原汁中礦物質組成及含量:利用原子吸收光譜法檢測到了7種礦質元素的含量,其中Ca和Mg平均含量較高,而Fe、Zn、Mn、Cr、Cu平均含量相對較低。見表3。
表3 金絲小棗原汁中礦物質的平均含量(n=3)
2.2 紅棗原汁中特殊營養(yǎng)成分組成及含量 實驗得到各特殊營養(yǎng)成分標準曲線相應回歸方程及相關系數(shù)(表4)、蘆丁色譜圖(圖2)和環(huán)磷酸苷色譜圖(圖3)。計算得到紅棗原汁中總酚平均含量(以沒食子酸計)為1.34 mg/mL;總黃酮平均含量(以蘆丁計)為157.3 μg/mL;蘆丁平均含量為7.15 μg/mL,cAMP、cGMP平均含量分別為19.17和8.11 μg/mL(n=3)。
表4 特殊營養(yǎng)成分的標準曲線回歸方程和相關系數(shù)Tab.4 Linear regression equations and their correlation coefficients of special nutrients
圖2 蘆丁對照品(A)和樣品溶液(B)的HPLC色譜圖。Fig.2 HPLC chromatograms of rutin standard (A)and sample solutions (B)
本研究的生物活性成分分析結果顯示該新型樂陵金絲小棗原汁中的碳水化合物包括游離單糖葡萄糖、果糖、蔗糖和水溶性多糖,其中葡萄糖和果糖含量居高,蔗糖含量較少,同時含有一定量的多糖。蔗糖、葡萄糖、果糖都是人體容易吸收的營養(yǎng)物質,特別是果糖不需要胰島素來代謝。棗多糖多具有提高機體免疫力、抗氧化、抑制癌細胞增殖和保肝護肝等生理活性[1]。
該新型樂陵金絲小棗原汁中含有至少15種氨基酸,種類較齊全,其中包括人體不能合成的丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸,以及兒童體內必需又不能合成的組氨酸和精氨酸。氨基酸是構建生物機體的眾多生物活性大分子之一,是構建細胞、修復組織的基礎材料,被人體用于制造抗體蛋白以對抗細菌和病毒的侵染,制造血紅蛋白以傳送氧氣,制造酶和激素以維持和調節(jié)新陳代謝。
該新型樂陵金絲小棗原汁中含有多種人體所需礦質元素,其中Ca和Mg含量較高,F(xiàn)e、Zn、Mn、Cr、Cu含量較低。適量的微量元素是人體在生長發(fā)育過程中必不可少的重要物質,如果缺乏就會導致相應的疾病,如鈣除作為骨質主要構成外,還能增加毛細血管壁致密度,降低其通透性,減少滲出,具有抗炎、消腫、抗組織胺作用;鎂可起到解毒的作用[13];鐵是人體血液中交換和輸送氧所必需的元素,在生物催化、呼吸鏈上傳遞電子等方面起著重要作用,缺乏會導致貧血、免疫力下降等[14];錳參與激素、維生素的代謝,還參與激活體內多種酶類,并與人體衰老和疾病的發(fā)生密切相關;缺銅的患者常伴有白細胞減少,抵抗力減低,容易感染等癥狀[15]。
另外,該棗汁中特殊營養(yǎng)成分包括酚類、黃酮和環(huán)核苷酸等。酚類有明顯的鎮(zhèn)靜、催眠和降壓作用;黃酮類類化合物具有抗氧化、延緩衰老、預防心血管疾病、降血壓、降血脂、降血糖等生理活性[16];環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷共同參與多種生理過程調節(jié),并參與基因轉錄,從而影響蛋白質合成;對人體細胞起著重要的生理調節(jié)作用,能增加肌力,擴展血管,增加心肌收縮力,改善心肌營養(yǎng),達到抗癌和消除疲勞的作用[17]。
綜上所述,樂陵金絲小棗中的各種營養(yǎng)成分對機體具有保護作用,除了保護肝臟、健脾養(yǎng)胃、抗腫瘤等功效外,對神經(jīng)系統(tǒng)和心血管的正?;顒佣加休^為明顯的作用,可廣泛應用于醫(yī)藥、保健品及醫(yī)用食品,尤其是作為綠色生物醫(yī)藥產(chǎn)品,具有廣闊的市場前景和應用價值。本研究測定了新型樂陵金絲小棗原汁中所含游離糖、多糖、氨基酸、礦物質、總酚、總黃酮、蘆丁和環(huán)磷酸苷的含量,表明該金絲小棗原汁中含有豐富的營養(yǎng)成分,值得進一步開發(fā)推廣。
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(編校:王儼儼)
Analysis of bioactive components of novel jujube beverage from LaolingZizyphusJujubacv. Jinsixiaozao
YANG Mei1,2, WANG Ying1,2, ZHAO Zhong-xi1,2Δ
(1.School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Ji’nan 250100, China; 2.Shandong Engineering & Technology Research Center for Jujube Food and Drug, Ji’nan 250012, China)
ObjectiveTo detect the main nutritional components of novel jujube beverage from LaolingZizyphusJujubacv. Jinsixiaozao.MethodsFree monosaccharides in novel jujube juice were determined by the HPLC-RID method while water-soluble polysaccharides were analyzed by UV spectrophotometric method with the phenol-sulfuric acid derivatization. Amino acid and mineral contents were obtained by the automatic amino acid analyzer and atomic absorption photometric methods, respectively. The quantification of total phenolic and flavonoids was accomplished by the UV spectrophotometric method after the respective complexation of the Folin-Ciocalteu reagent and aluminum nitrate. The contents of rutin and cyclic nucleotides were determined by the HPLC-UV method.ResultsThe average contents of sucrose, glucose, fructose and polysaccharides in novel jujube juice were 3.85, 32.5,27.3 and 3.6 mg/mL, respectively. The total amino acid average content was 269.7 μg/mL. The mineral average contents of Ca, Fe, Mg, Zn, Mn, Cr, and Cu were 35.1,0.85, 55.8, 0.85, 0.44, 0.41, 0.21 μg/mL, respectively. The novel jujube juice contained average 1.34 μg/mL rutin equivalents of total phenolics and average 157.3 μg/mL gallic acid equivalents of total flavonoids. Finally, the average amounts of rutin, cAMP and cGMP were 7.15, 19.17 , and 8.11 μg/mL, respectively.ConclusionThe newly developed jujube juice is worthwhile further marketing development attributed to its rich nutritional components and healthy values.
jujube juice; free sugars; polysaccharides; amino acids; minerals; phenolics; flavonoids; cyclic nucleotides
國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2012CB126315)
楊梅,女,碩士研究生,研究方向:功能食品開發(fā),E-mail: yangmeilhn@foxmail.com;趙忠熙,通信作者,男,博士,教授,研究方向:新藥創(chuàng)制及功能食品開發(fā),E-mail: zxzhao@sdu.edu.cn。
S665.1
A
1005-1678(2015)11-0161-05