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    雞miR-20a靶基因TP53INP1鑒定

    2015-07-05 17:16:45王寧段逵宋鶴張瀟飛張?zhí)炷?/span>張文建閆曉紅王守志李輝
    關(guān)鍵詞:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)基因簇報告基因

    王寧,段逵,宋鶴,張瀟飛,張?zhí)炷?,張文建,閆曉紅,王守志,李輝

    (農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030)

    雞miR-20a靶基因TP53INP1鑒定

    王寧,段逵,宋鶴,張瀟飛,張?zhí)炷浚瑥埼慕?,閆曉紅,王守志,李輝

    (農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室,東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,哈爾濱150030)

    前期研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-17-92基因簇能促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖,但作用機(jī)制尚不清楚。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),TP53INP1是miR-17-92基因簇成員miR-17-5p和miR-20a的潛在靶基因,研究采用熒光素酶報告基因技術(shù)和基因過表達(dá)技術(shù)開展該靶基因的驗證。結(jié)果表明,過表達(dá)miR-17-92基因簇能顯著抑制TP53INP1的3' UTR報告基因活性;而轉(zhuǎn)染miR-20a抑制劑能顯著提高TP53INP1的3'UTR報告基因活性。將miRNA抑制劑分別轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞和雞前脂肪細(xì)胞中,采用real-time RT-PCR方法檢測細(xì)胞TP53INP1基因表達(dá)變化。結(jié)果顯示,miR-20a抑制劑能促進(jìn)TP53INP1表達(dá),TP53INP1是miR-20a的一個靶基因。

    雞;miR-17-92基因簇;前脂肪細(xì)胞;TP53INP1;基因表達(dá)

    miRNA是一類非編碼小RNA分子,通過與靶mRNA不完全堿基互補(bǔ)配對,導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制,調(diào)控靶基因表達(dá)[1]。miRNA是機(jī)體發(fā)育中必不可少的小RNA分子,目前很多研究證明,miRNA參與動物細(xì)胞發(fā)育、增殖,分化、凋亡及代謝等過程[2-3]。miRNA基因在染色體上的分布非隨機(jī),miRNA基因緊密相鄰,排列成簇[4-5]。miR-17-92基因簇是目前受關(guān)注miRNA簇之一,該基因簇能編碼產(chǎn)生miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b和miR-92等成員,該簇miRNA成員在多種腫瘤中高表達(dá),過表達(dá)會導(dǎo)致疾病和癌癥發(fā)生[6-7]。

    人體miR-17-92基因簇位于13號染色體C13orf25上[8],該miRNA簇在動物發(fā)育和疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用,可增加成骨細(xì)胞增殖能力[9],調(diào)節(jié)脂肪形成多個信號通路[10]。本研究前期在雞前脂肪細(xì)胞小RNA重測序中發(fā)現(xiàn)mir-17-92基因簇在雞前脂肪細(xì)胞中表達(dá)[11],進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-17-92基因簇過表達(dá)能促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖(未發(fā)表)。但miR-17-92基因簇促進(jìn)雞脂肪細(xì)胞增殖的機(jī)制仍不清楚。

    TP53INP1是一個p53誘導(dǎo)核蛋白1,TP53INP1能影響細(xì)胞進(jìn)程,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡等[12-13]。本研究生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),TP53INP1基因3'UTR存在miR-17-92基因簇成員miR-20a和miR-17-5p的集合位點,提示TP53INP1就是miR-17-92基因簇的靶基因[14]。為揭示miR-17-92基因簇促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,本研究開展雞miR-17-92基因簇靶基因TP53INP1鑒定。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    脂肪組織來自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇系(NEAUHLF)高脂雞,miR-17-92基因簇過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-miR-17-92、雞前脂肪細(xì)胞(ICPA)和胚胎成纖維細(xì)胞(DF1)均為農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室保存,psiCHECK2載體購自Promega公司,miR-17-5p inhibitor、miR-20a inhibitor、miR-19a inhibitor和miR-19b inhibitor購自上海吉瑪公司。

    1.2RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

    使用Trizol提取東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高、低脂雙向選擇系(NEAUHLF)的高脂雞脂肪組織,雞胚胎成纖維DF1細(xì)胞和ICPA細(xì)胞總RNA,以A260/A280比值在(1.8~2.0)高質(zhì)量的RNA作為模板,采用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

    1.3 載體構(gòu)建

    以東北農(nóng)業(yè)大學(xué)高低脂雙向選擇系(NEAUHLF)高脂雞脂肪組織cDNA為模版,使用primer 5.0設(shè)計引物(見表1),采用RT-PCR擴(kuò)增TP53INP1(NM_001030946.1)的3'UTR,該片段包含miR-17-92基因簇成員結(jié)合位點的片段(835 bp);將擴(kuò)增片段克隆到含有XhoⅠ和NotⅠ酶切位點的psi-CHECK2雙熒光素酶報告基因載體上,構(gòu)建成psi-CHECK2-TP53INP1。

    表1RT-PCR引物和real-time PCR引物序列Table 1Primer sequences for RT-PCR and real-time PCR

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

    DF1和前脂肪細(xì)胞均采用完全培養(yǎng)基(DMEM/ F12+10%FBS),并在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前,將細(xì)胞按照每孔1×104密度接種到六孔板,待細(xì)胞完全貼壁并生長至70%~80%密度時轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染參照Invitrogen脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書。將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至六孔板細(xì)胞中;每孔加入質(zhì)粒2 μg,轉(zhuǎn)染試劑8 μL;轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,檢測熒光素酶活性。

    1.5 熒光素酶活性檢測

    使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)分別檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性,報告基因活性結(jié)果以螢火蟲/海腎相對值表示,所有試驗均重復(fù)3次并計算標(biāo)準(zhǔn)差。

    1.6 實時熒光定量PCR(real-time PCR)

    使用real-time PCR儀型號為ABI 7500。反應(yīng)體系為:Roche FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(2×)5 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.6 μL,總體積10 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s,95℃變性5 s,60℃復(fù)性延伸34 s,共40個循環(huán)。溶解曲線95℃15 s,60℃10 min,95℃15 s,每個樣品設(shè)3孔重復(fù)。以NONO基因為內(nèi)參,利用2-△△Ct方法將原始Ct值轉(zhuǎn)換為相對基因表達(dá)量。所用引物序列見表1。

    1.7 數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)分析采用Student's t-test,運用SAS 9.2軟件完成,數(shù)據(jù)格式表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)。統(tǒng)計分析P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1TP53INP1基因3'UTR生物信息學(xué)分析

    雞TP53INP1基因(NM_001030946.1)的3'UTR長度是4 008 bp。應(yīng)用UCSC數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),雞、獼猴、鼠、狗、大象及熱帶爪蟾等TP53INP1基因3'UTR基因組序列存在同源性較高區(qū)域(見圖1),提示該區(qū)域可能是重要的TP53INP1表達(dá)調(diào)控元件。進(jìn)一步采用在線miRNA靶基因分析軟件Targetscan分析發(fā)現(xiàn),雞TP53INP1基因mRNA的3'UTR存在miR-17-92基因簇成員miR-17-5p和miR-20a的潛在靶結(jié)合位點;比較分析顯示,TP53INP1基因3'UTR的這兩個潛在miRNA結(jié)合位點在各物種非常保守,這兩個miRNA種子區(qū)結(jié)合序列在雞、人、鼠、豬等動物中完全相同(見圖2)。

    圖1TP53INP1基因3'UTR的同源性分析Fig.1Homology analysis of TP53INP1 3'UTR

    圖2 雞TP53INP1 3'UTR的miR-17-92基因簇miRNA成員結(jié)合區(qū)分析Fig.2Predicted miRNA binding sites of miR-17-92 cluster in chicken TP53INP1 3'UTR

    2.2miR-17-92基因簇對TP53INP1的調(diào)節(jié)作用分析

    為確定miR-17-92基因簇是否靶作用于TP53INP1上的3'UTR,構(gòu)建雞TP53INP1的3'UTR熒光素酶報告基因載體(psiCHECK2-TP53INP1)(見圖3),酶切測序正確無誤后,將miR-17-92基因簇pcDNA3.1-miR-17-92過表達(dá)質(zhì)粒和psi-CHECK2-TP53INP1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞,48 h后收細(xì)胞,使用熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定螢火蟲/海參熒光素酶相對活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與pcDNA3.1-control相比,pcDNA3.1-miR-17-92能極顯著抑制psiCHECK2-TP53INP1熒光素酶報告基因活性達(dá)5倍以上(P<0.01)(見圖4)。這表明miR-17-92家族成員可能直接調(diào)控TP53INP1表達(dá)。

    圖3psiCHECK2-TP53INP1載體雙酶切驗證Fig.3Identification of psiCHECK2-TP53INP1 plasmid by double enzyme digestion with XhoⅠand NotⅠ

    圖4miR-17-92基因簇對psiCHECK2-TP53INP1報告基因活性影響Fig.4Effect of miR-17-92 cluster overexpression on relative luciferase activity of psiCHECK2-TP53INP1

    2.3miR-20a對TP53INP1的調(diào)節(jié)作用

    生物信息學(xué)分析顯示,miR-17-92基因簇中miR-17-5p,miR-20a均靶作用于TP53INP1,為確定這兩個miRNA成員是否作用于TP53INP1,利用miR-17-5p和miR-20a的inhibitor與psiCHECK2-TP53 INP1共轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中,測定相對熒光活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與inhibitor NC相比,miR-17-5p inhibitor和miR-20a inhibitor均能提高報告基因活性,其中miR-20a達(dá)到顯著水平(P<0.05)(見圖5),結(jié)果表明miR-20a可能靶作用于TP53INP1。

    圖5 轉(zhuǎn)染miR-17-5p inhibitor和miR-20a inhibitor對psiCHECK2-TP53INP1報告基因活性影響Fig.5Effect of miR-17-5p inhibitor and miR-20a inhibitors on reporter activity of psiCHECK2-TP53INP1

    為進(jìn)一步驗證miR-17-5p和miR-20a是否靶作用于TP53INP1,使用miR-17-5p、miR-20a、miR-19a和miR-19b的inhibitor,轉(zhuǎn)染到DF1細(xì)胞中,以miRNA inhibitor NC作為陰性對照,24和48 h后使用real-time RT-PCR檢測TP53INP1在DF1細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與miRNA inhibitor NC相比,轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor顯著提高TP53INP1表達(dá)水平,而轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-19a和miR-19b的inhibitor對TP53INP1的mRNA表達(dá)水平未發(fā)生顯著變化(P>0.05)(見圖6)。此結(jié)果與報告基因分析結(jié)果一致,說明在DF1細(xì)胞中雞miR-20a靶作用于TP53INP1。

    采用同樣方法,分析miR-17-5p,miR-19a,miR-19b,miR-20a的inhibitor,對雞前脂肪細(xì)胞內(nèi)源性TP53INP1表達(dá)影響,結(jié)果與DF1細(xì)胞結(jié)果一致,轉(zhuǎn)染miR-20a的inhibitor顯著提高細(xì)胞TP53INP1表達(dá)水平(P<0.05)。但轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-19a和miR-19b的inhibitor后,未發(fā)現(xiàn)TP53INP1表達(dá)水平發(fā)生顯著變化(P>0.05)(見圖7)。同樣也說明在前脂肪細(xì)胞中只有miR-20a對TP53INP1表達(dá)有調(diào)控作用。

    圖6 轉(zhuǎn)染miR-17-5p、miR-17-9a和miR-20a的inhibitor對DF1細(xì)胞中內(nèi)源性TP53INP1表達(dá)影響Fig.6Effect of miR-17-5p,miR-17-9a and miR-20a inhibitors on relative TP53INP1mRNA expression in DF1 cells

    圖7 轉(zhuǎn)染miR-17-5p和miR-20a的inhibitor對雞前脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性TP53INP1表達(dá)的影響Fig.7Effect of miR-17-5p and miR-20a inhibitors on relative TP53INP1 mRNA expression in ICPA cells

    3 討論與結(jié)論

    本研究采用生物信息學(xué)、報告基因技術(shù)證實TP53INP1是miR-17-92基因簇miR-20a的一個靶基因。miR-20a結(jié)合位點在人、鼠、雞等動物TP53INP1基因3'UTR高度保守,推測TP53INP1是miR-17-92基因簇的重要保守靶基因。多個研究支持這一推測[6-14]。

    TP53INP1具有抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。在人體宮頸癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn),miR-20a/ miR-17-5p靶作用于TP53INP1基因,促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖[13-15];在人體胃癌研究中發(fā)現(xiàn),miR-20a/ miR-17-5p靶作用于p21和TP53INP1,從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖[6]。農(nóng)業(yè)部雞遺傳育種重點實驗室之前研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-17-92基因簇促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖,但機(jī)制仍不清楚。本研究證實,miR-17-92基因簇成員miR-20a靶作用于TP53INP1??紤]到miR-17-92基因簇靶基因眾多,推測miR-17-92基因簇可能至少部分通過抑制TP53INP1基因表達(dá),從而促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞增殖。后續(xù)將以拯救試驗確認(rèn)miR-20a是否作用于TP53INP1而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

    與人TP53INP1研究結(jié)果不同,發(fā)現(xiàn)雞miR-20a能靶向作用于TP53INP1,但miR-17-5p對TP53INP1并無明顯作用。雞miR-17-5p和miR-20a種子區(qū)相同,但miR-17-5p對雞TP53INP1無明顯作用,推測miRNA作為一個反式作用因子,在發(fā)揮調(diào)控時還需其他蛋白、非編碼RNA等參與,在不同細(xì)胞中其靶基因并不完全相同[16-17]。

    TP53INP1基因是miR-20a的靶基因;抑制其表達(dá),miR-17-92基因簇可能是通過靶向抑制TP53INP1表達(dá),促進(jìn)雞脂肪細(xì)胞增殖。

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    Identification ofTP53INP1 as a targets gene of chicken miR-20a

    The previous studies showed that overexpression of miR-17-92 cluster promoted the chicken preadipocyte proliferation,however,the underlying molecular mechanism remains unclear. Bioinformatics analysis found thatTP53INP1 was a potential target gene of miR-17-5p and miR-20a encoded by the miR-17-92 cluster.In the present study,we verified this bioinformatics analysis result using a luciferase reporter assay and miRNA overexpression and knockdown.The results showed that miR-17-92 cluster significantly decreasedTP53INP1 3?UTR luciferase reporter activity;transfection of miR-20a inhibitor significantly decreasedTP53INP1 3?UTR luciferase reporter activity.Real-time RT-PCR expression analysis showed that transfection of miR-20a inhibitor increased the endogenousTP53INP1 expression in DF1cells and immortalized chicken preadipocytes.Taken together,these data suggest thatTP53INP1 is a target gene of miR-20a.

    chicken;miR-17-92 cluster;preadipocytes;TP53INP1;gene expression

    S831;Q786

    A

    1005-9369(2015)09-0069-06

    時間2015-9-23 9:38:13[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.018.html

    王寧,段逵,宋鶴,等.雞miR-20a靶基因TP53INP1鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2015,46(9):69-74.

    Wang Ning,Duan Kui,Song He,et al.Identification ofTP53INP1 as a targets gene of chicken miR-20a[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):69-74.(in Chinese with English abstract)

    2015-04-20

    國家自然科學(xué)基金項目(31372299);國家863課題(2011AA100301)

    王寧(1964-),男,教授,博士,博士生導(dǎo)師,研究方向為動物遺傳育種與繁殖。E-mail:wangning@neau.edu.cn

    /WANGNing,DUAN Kui,SONG He,ZHANG Xiaofei,ZHANG Tianmu,ZHANG Wenjian,YAN Xiaohong, WANG Shouzhi,LI Hui

    (Key Laboratory of Chicken Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture, School ofAnimal Sciences and Technology,NortheastAgricultural University,Harbin 150030,China)

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