雞源空腸彎曲菌調(diào)查與耐藥性分析

孫桂霞，徐世文

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱150030）

雞源空腸彎曲菌調(diào)查與耐藥性分析

孫桂霞，徐世文*

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱150030）

空腸彎曲菌是嚴重危害人畜健康的病原菌，為了解哈爾濱市肉雞源性空腸彎曲菌流行病學和耐藥性，研究調(diào)查哈爾濱市周邊肉雞場空腸彎曲菌感染狀況，通過耐藥性和耐藥基因檢測，發(fā)現(xiàn)雞場平均感染率為35.67%，對13種抗生素均有不同程度耐藥性，四環(huán)素和氨芐西林鈉達100%，存在多重耐藥性，最高耐藥譜達11個，檢出菌株率為14.95%。57.94%菌株攜帶tetA、tetB、tetC、blaCTX-M、blaTEM和blaNDM-1基因，檢出率分別為57.94%、66.36%、28.97%、42.99%、55.14%和8.41%，而tetD和blaSHV-1基因未檢出。結(jié)果表明，哈爾濱市肉雞場空腸彎曲菌感染普遍，存在多重耐藥并攜帶多種耐藥基因，為有效防治空腸彎曲菌病提供依據(jù)。

肉雞；空腸彎曲菌；耐藥性；耐藥基因

空腸彎曲菌是常見的人獸共患病原菌。人類除引起腸炎外，還可引起中毒、肝炎、關(guān)節(jié)炎和格林-巴利綜合癥等免疫損傷性疾病[1-2]。獸醫(yī)臨床上常見癥狀是腹瀉，此外也見于乳房炎、不孕、流產(chǎn)和禽類肝炎[3]。世界衛(wèi)生組織已將該病列為最常見的食源性傳染病之一，我國在上海、北京、福建等地多次報道經(jīng)食物感染該菌引發(fā)的疾病[4]。動物產(chǎn)品是人感染空腸彎曲菌主要來源，雞肉和雞蛋是主要消費動物性食品。雞是空腸彎曲菌病重要傳染源，消費雞肉與空腸彎曲菌的流行緊密相關(guān)[5]。開展肉雞空腸彎曲菌流行病學調(diào)查，掌握其流行情況，采取相應(yīng)方法預防尤為重要。本研究調(diào)查哈爾濱市5個大型雞場肉雞空腸彎曲菌感染情況，通過耐藥性試驗和耐藥基因檢測，為了解哈爾濱市不同雞場空腸彎曲菌流行分布狀況，闡明其流行規(guī)律、耐藥性以及預測其流行趨勢和有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣本及來源

樣本采自哈爾濱市5個肉雞場，每個雞場采集28、42日齡肉雞各30份肛試子，共300份，樣品采集后置于運送培養(yǎng)基中，于24 h內(nèi)送達東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院獸醫(yī)內(nèi)科實驗室，并立即檢測。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

改良Camp-BAP培養(yǎng)基和改良布氏肉湯購自青島海博有限責任公司；氨芐西林、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、厄他培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、替吉環(huán)素和多黏菌素，購自中國藥品生物制品監(jiān)督所；Taq DNA聚合酶（5 U·μL-1）、10×PCR buffer、25 mmol·L-1MgCl2、Dntp mixture（各2.5 mmol·L-1）、DNA Marker DL2000等購自寶生物工程（大連）有限公司，其他均為常規(guī)化學試劑。

1.2 方法

1.2.1 空腸彎曲菌分離培養(yǎng)與鑒定

空腸彎曲菌分離鑒定按GB/T 4789.9-2008標準進行[6]。

1.2.2 藥敏試驗

按照微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標準檢測[7]。

1.2.3 耐藥基因檢測

根據(jù)GenBank已發(fā)表耐藥基因序列，參考張博試驗設(shè)計[8]，對空腸彎曲菌進行8種耐藥基因PCR檢測，其中包括四環(huán)素類耐藥基因（tetA、tetB、tetC和tetD）和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（blaSHV-1、blaCTX-M、blaTEM和blaNDM-1）。引物由上海生工合成，如表1所示。PCR體系取模板cDNA 2.0 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各1 μL，混合Tag酶9.5 μL，加入滅菌雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為，95℃預變性5 min，94℃變性30 s，60℃30 s，72℃30 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，于3.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以檢測擴增效果。

表1 擴增目的基因引物序列及目的片段長度Table 1Primer sequence and amplification length of destination fragment

2 結(jié)果與分析

2.1 肉雞場空腸彎曲菌檢出率

按照國標空腸彎曲菌檢驗（GB/T 4789.9-2008）方法[6]，通過對300份病料分離培養(yǎng)，共鑒定出陽性病料107份，陽性率為35.67%，但不同雞場污染率不同，最高檢出率為78.33%（47/60），最低檢出率為8.33%（5/60）。

2.2 空腸彎曲菌耐藥性檢測結(jié)果

由表2可知，總耐藥率最高為四環(huán)素（92.52%），最低為多粘菌素（5.61%）。但各雞場耐藥性差異較大，如E場對四環(huán)素、氨芐西林耐藥率達100%，而D場對慶大霉素耐藥率為100%。

由表3可知，分離出的空腸彎曲菌存在多重耐藥性，在檢測的13種抗生素藥物中，最高耐藥譜達到11個，檢出菌株率為14.95%。多粘菌素具有較高敏感性。

2.3 耐藥基因的檢測結(jié)果

由表4可知，分離出的空腸彎曲菌中有57.94%攜帶tetA基因，攜帶tetB基因為66.36%，攜帶blaNDM-1基因檢出最低，為8.41%。而tetD和blaSHV-1基因未檢出。

表2 空腸彎曲菌分離株耐藥率分析結(jié)果Table 2Results about the resistant rate of Campylobacter jejuni separate strains

表3 空腸彎曲菌耐藥譜分析結(jié)果Table 3Antibiogram results of Campylobacter jejuni

表4 耐藥基因陽性菌株數(shù)量及檢出率Table 4Number and detection rate of positive strains resistant genes

3 討論與結(jié)論

3.1 雞源空腸彎曲菌流行病學調(diào)查結(jié)果分析

空腸彎曲菌是多種動物空腸中多見條件性致病菌，該菌在腸道內(nèi)大量繁殖，通過糞便排到體外，污染食物、水源，?？梢鹑祟惛腥尽Ａ餍胁W調(diào)查顯示，雞具有很高的帶菌率，不同地區(qū)帶菌率存在明顯差異。廣東地區(qū)雞、鴨和鵝空腸彎曲菌帶菌率分別為7.93%、2.46%和4.16%[9]。貴陽市雞、豬空腸彎曲菌帶菌率分別為17.33%、12.0%[10]。調(diào)查結(jié)果顯示，哈爾濱市5個肉雞場中空腸彎曲菌檢出率平均為35.67%，最高檢出率為78.33%（47/ 60），最低檢出率為8.33%，遠高于河南0.6%、江蘇7.6%、華東地區(qū)8.96%、山東30.8%的分離率，低于上海43.2%、安徽45.2%、浙江30.4%等地的分出率[11-15]。研究表明，雞群攜帶空腸彎曲菌最高可達100%[16]。

3.2 雞源空腸彎曲菌耐藥性分析

四環(huán)素類和β內(nèi)酰胺類藥物是獸醫(yī)臨床上常用的抗生素，隨該藥物大量使用，細菌耐藥問題嚴重，已引起關(guān)注。Reina和Bardon研究證實，空腸彎曲菌對壯觀霉素、慶大霉素耐藥性為1.0%～9.4%[17-18]，Luangtongkum等研究表明，空腸彎曲菌對紅霉素耐藥率為80%[19]，Jain等報道，空腸彎曲菌對四環(huán)素耐藥率僅為26.5%[20]。韓新鋒等對成都市及雅安市肉雞生產(chǎn)鏈調(diào)查表明，空腸彎曲菌分離株對環(huán)丙沙星、左氟沙星、四環(huán)素和克林霉素耐藥率較高，分別為94.44%、93.89%、91.67%和78.33%，對紅霉素（20.00%）、鏈霉素（20.56%）、慶大霉素（17.78%）、氟苯尼考（12.22%）呈現(xiàn)不同耐藥率[21]。本試驗調(diào)查顯示，分離空腸彎曲菌株對四環(huán)素耐藥率最高（92.52%），其次為環(huán)丙沙星（84.11%），再次為氨芐西林耐藥率為80.37%。這與國內(nèi)報道不完全一致[22-23]。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲菌存在多重耐藥譜，與多數(shù)報道一致[24]，表明臨床上存在抗生素濫用。

臺灣、泰國和西班牙的研究資料顯示，空腸彎曲菌氟喹諾酮抗性比率分別是56.9%、84%和75%～88%[25-27]。耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，分離株空腸彎曲菌普遍攜帶耐藥基因。Andersen等調(diào)查丹麥空腸彎曲菌耐藥性，研究結(jié)果表明，彎曲桿菌攜帶多種耐藥基因，如tetA、tetB、blaCTX-M和blaTEM等[28]。姜毅等研究發(fā)現(xiàn)，對環(huán)丙沙星耐藥的15株空腸彎曲菌均檢測出在gyrA基因257位發(fā)生點突變[24]。Kurincic等證實CmeABC外排泵在彎曲桿菌固有紅霉素耐藥性和獲得低水平紅霉素耐藥性中的作用[29]。Ge等證實，cmeB失活可影響空腸彎曲菌對氯霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素和四環(huán)素的敏感性[30]。空腸彎曲菌分離菌群對喹諾酮類有更高的耐藥水平，其有兩個突變，一個在gyr的Th-r86上，另外在拓撲異構(gòu)酶IV殘基的Arg-139上[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，分離株空腸彎曲菌耐藥基因攜帶率較高，tetB為66.36%，tetA為57.94%，blaTEM為55.14%，blaCTX-M為42.99%，表明所調(diào)查雞場感染的空腸彎曲菌普遍攜帶耐藥基因，結(jié)論可為雞場防治空腸彎曲菌病、有效消除耐藥性和耐藥基因傳播提供理論依據(jù)。

[1]王振國,秦學,鄭希銘,等.雞肉中彎曲桿菌屬的分離與鑒定[J].中國人獸共患病雜志,2001,17(1)：63-64.

[2]Schmid M W,Lehner A.Development and application of oligonucleotide probes for in situ detection of thermotolerant Campylobacter in chicken faecal and liver samples[J].International Journal of Food Microbiology,2005,105(2)：245-255.

[3]Ang C W,Doorn P A,Endtz H P,et al.A case of Guillain-Bajrre syndrome following a family outbreak of Campylobacter jejuni enteritis[J].J Neuroimmunol,2000(11)：29-32.

[4]龔振華,張康,王麗萍,等.肉雞空腸彎曲桿菌的監(jiān)測與分析[J].中國家禽,2014,36(10)：59-62.

[5]黃武,饒雷,張凱,等.禽源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及其致病性的初步研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(5)：173-176.

[6]中華人民共和國國家標準.食品衛(wèi)生微生物檢驗空腸彎曲菌檢驗(GB/T 4789.9-2008)[S].北京：中國標準出版社,2010.

[7]倪語星,洪秀華.細菌耐藥性檢測抗感染治療[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2002：54-57.

[8]張博.城市污水中腸桿菌的抗生素耐藥性和多種耐藥基因的檢測[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學,2013.

[9]黃武,饒雷,張凱,等.禽源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及其致病性的初步研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2013,40(3)：173-177.

[10]隆昌飛,譚艾娟,呂世明,等.豬、雞空腸彎曲桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].天津農(nóng)業(yè)科學,2013,19(3)：43-45.

[11]倪語星,洪秀華.細菌耐藥性檢測抗感染治療[M].北京：人民軍醫(yī)出版社,2002：54-57.

[12]薛峰,欒軍,張小榮,等.2006-2008年江蘇地區(qū)不同宿主感染空腸彎曲菌及其耐藥性[J].中國人獸共患病學報,2009,25(12)：1206-1209.

[13]張秀麗,廖興廣,張丁.2005年河南省食源性致病菌和耐藥性監(jiān)測[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(7)：842-844.

[14]薛峰,徐飛,陳穎,等.2006-2008年華東地區(qū)空腸彎曲菌動物源分離株分子分型研究[C].動物檢疫學分會.2010年年會論文集.烏魯木齊：中國畜牧獸醫(yī)學會,2010：112-116.

[15]侯佩興,侯建軍,吳忠亮,等.豬空腸彎曲桿菌感染狀況的地域差異性研究[J].上海交通大學學報：農(nóng)業(yè)科學版,2009,27(5)：513-519.

[16]Smith M V,Muldoon P J.Campylobacter fetus subspecies jejuni (Vibrio fetus)from commercially processed poultry[J].Applied Microbiology,1974,27(5)：995-996.

[17]Reina J.Susceptibilities to 10 antimicrobial agents of 1 220 Campylobacter strains isolated from 1987 to 1993 from feces of pediatric patients[J].Antimicrob Agents Chemother,1994,38(12)：2917.

[18]Bardon J.Prevalence of Campylobacter jejuni and its resistance to antibiotics in poultry in the Czech Republic[J].Zoonoses and Public Health,2008,56：111-116.

[19]Luangtongkum T,Morishita T Y,Ison A J,et al.Effect of conventional and organic production practices on the prevalence and antimicrobial resistance of Campyloba cter spp.In poultry[J].Appl Environ Microbiol,2006,72(5)：3600-3607.

[20]Jain D,Sinha S,Prasad K N,et al.Campylobacter apecies and drug resistance in a north Indian rural community[J].Trans R Soc Trop Med Hyg,2005,99(3)：207-214.

[21]韓新鋒,劉書亮,陳荀,等.雞肉生產(chǎn)鏈空腸彎曲桿菌的耐藥性研究[J].中國人獸共患病學報,2013,29(2)：199-205.

[22]姜峰.空腸彎曲菌流行病學及在雞肉低溫貯藏過程中失活動力學特征研究[D].揚州：揚州大學,2012.

[23]許海燕,黃金林,包廣宇,等.揚州市區(qū)腹瀉人群空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌流行狀況及耐藥性分析[J].中國人獸共患病學報, 2008,24(1)：58-62

[24]姜毅,楊鳳娥,侯建軍,等.空腸彎曲桿菌耐藥性及其主要相關(guān)基因初步分析[J].中國獸藥雜志,2008,42(12)：9-13.

[25]Saenz Y,Zarazaga M,Lantero M,et al.Antibiotic resistance in Campylobacterstrains isolated from animals,foods and humans in Spain in 1997-1998[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44：267-271.

[26]Li C C,Chiu C H,Wu J L,et al.Antimicrobiol susceptibilities of Campylobacter jejuni and coli by using E-test in Taiwan[J].Scan J Infect Dis,1998,30：39-42.

[27]Hoge C W,Gambel J M,Srijian A,et al.Trends in antibiotic resistance among diarrheal pathogens isolated in Thailand over 15 years[J].Clin Infect Dis,1998,26：341-345.

[28]Andersen S R,Saadbye P,Sukri N M,et al.Antimicrobial resistance among Campylobacter jejuni isolated from raw poulatry meat at retail level in Denmark[J].Int J Food Microbiol,2006,107(3)：250-255.

[29]Kurincic M,Botteldoorn N,Herman L,et al.Mechanisms of erythromycin resistance of Campylobacter app.Isolated from food,animals and hunmans[J].Int J Food Microbiol,2007,120(1/2)：186-190.

[30]Ge B,McdErmott P F,White D G,et al.Role of efflux pumps and topoisomerase mutatiins in fluoro quinolone resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli[J].Antimicrob Agents Chemother,2005,49(8)：3347-3354.

[31]Gibreel A,Sjogren E,kajser B,et al.Rapid emergence of highlevel resistance to quinolones in Campylobacter jejuni associated with mutational changes in gyrA and parC[J].Antimicrob Agents Chemother,1998,42：3276-3278.

Investigation and resistance analysis ofCampylobacter jejuniin broiler/

SUN Guixia,XU Shiwen
(School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Campylobacter jejuniis a kind of pathogenic bacteria which cause serious damage to the human and animal health.To understand the epidemiological and drug resistance ofCampylobacter jejuniin broiler of Harbin,the present study investigated the infection status ofCampylobacter jejuniin broiler in Harbin and its surrounding area,meanwhile,detected the drug resistance and expression of resistant genes. The results showed that the average infections of chicken farms were 35.67%.Campylobacter jejunihad different degrees of antibiotic resistance to 13 kinds of antibiotics,which the antibiotic resistance of tetracycline and ampicillin sodium were 100%,while there were multiple drug resistance.The highest drug-resistant spectrums were 11,while the detection rate of bacterial strain was 14.95%.57.94%bacterial strain containedtetA,tetB,tetC,blaCTX-M,blaTEMandblaNDM-1 genes,that the detection rate were 57.94%,66.36%,28.97%,42.99%,55.14%and 8.41%,respectively.However,the present study didn't detecttetDandblaSHV-1 genes.The results showed that the infections ofCampylobacter jejuniin chicken farms of Harbin were occured commonly,while there were multiple drug resistance.It provided the basis for effective prevention and treatment ofCampylobacter jejuni.

broiler;Campylobacter jejuni;drug resistance;resistance genes

S831

A

1005-9369（2015）09-0064-05

時間2015-9-23 9：38：10[URL]http：//www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150923.0938.012.html

孫桂霞,徐世文.雞源空腸彎曲菌調(diào)查與耐藥性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2015,46(9):64-68.

Sun Guixia,Xu Shiwen.Investigation and resistance analysis ofCampylobacter jejuniin broiler[J].Journal of Northeast Agricultural University,2015,46(9):64-68.(in Chinese with English abstract)

2015-04-07

環(huán)保部公益性項目(200909043)

孫桂霞（1966-），女，獸醫(yī)師，博士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品安全。E-mail：746930375@qq.com

*通訊作者：徐世文，教授，博士生導師，研究方向為畜禽營養(yǎng)代謝病與中毒病。E-mail：shiwenxu@neau.edu.cn