馬鈴薯對晚疫病水平抗性的組織細胞學觀察

李惠霞，劉永剛，張俊蓮，王 蒂＊

（1 甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院，蘭州730070；2 甘肅省作物遺傳育種與種質創(chuàng)新重點實驗室，蘭州730070；3 甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所，蘭州730070）

馬鈴薯晚疫病又稱馬鈴薯瘟，是由致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）de Bary）引起的毀滅性病害，嚴重威脅著世界馬鈴薯生產［1，2］。致病疫霉屬于異宗配合菌物，有A1 和A2 兩種交配型，1956年墨西哥首次證實存在A2交配型，其他地區(qū)只有A1交配型。20世紀80年代以后，世界各地相 繼 發(fā) 現A2 交 配 型［3，4］，1996年 后 中 國 馬 鈴 薯 主栽區(qū)陸續(xù)出現A2交配型［5－7］。A2交配型的出現意味著病菌可進行有性生殖，引起群體結構發(fā)生變化，更易產生新的生理小種，從而使晚疫病的流行更為頻繁。與此同時，國內外陸續(xù)報道該病原菌對常用的藥劑甲霜靈產生了抗藥性［8－10］，化學防治效果受到了影響，因此，抗病品種的選育和利用顯得尤為重要。

育種實踐證明，由于晚疫病菌小種較多且變異迅速，很容易克服由一個或少數幾個基因控制的垂直抗性，使多年培育的品種推廣時間不長就失去了抗性［2］，而病原小種的快速變異是導致垂直抗性喪失的根本原因。馬鈴薯抗晚疫病育種目標已轉向利用多基因控制的非特異性的、抗性持久的水平抗性上。但對水平抗性的研究相對較少，特別是病原菌與寄主互作超微結構研究國內尚未見報道。本實驗以水平抗性材料和感病品種為研究對象，對接菌后24～72h內寄主與病原菌的互作進行系統的觀察和分析，探索其組織學和細胞學特征，揭示馬鈴薯水平抗性機理。

1 材料和方法

1.1 供試品種及來源

馬鈴薯晚疫病水平抗性材料LBr－12（CIP Code：387413.21，親本來源：374080.5×AVRDC1287.19）試管苗由國際馬鈴薯中心駐京辦事處謝開云博士惠贈；感病品種費烏瑞它（Favorite）試管苗由甘肅農業(yè)大學作物遺傳育種與種質創(chuàng)新重點實驗室保存。

1.2 供試病原菌

致病疫霉（P.infestans）分離自甘肅省定西、渭源和臨洮等縣馬鈴薯主栽地區(qū)病株的混合菌株，在黑麥培養(yǎng)基上18 ℃培養(yǎng)備用。

1.3 馬鈴薯培育與接種

MS培養(yǎng)基上擴繁的保存苗生長28d后，移栽至塑料缽（20cm×25cm）中，于18～25℃溫室中培養(yǎng)。生長42d后選取自頂部以下第3－5葉，葉背朝上，置于鋪有濾紙的搪瓷盤進行離體接種。游動孢子懸浮液制備參照朱杰華［11］的方法，游動孢子濃度約為5×104個／mL。接種后用塑料膜保濕24h，以清水處理為對照。接種后24、48和72h取樣，用于固定或染色。

1.4 馬鈴薯葉片組織染色和觀察

葉片接種后不同時間，用直徑為6 mm 打孔器取樣，每個品種取5個葉盤。按Bruzzese［12］方法整葉透明，苯胺藍染色法進行處理，略加改動，固定染色48h，然后在飽和水合氯醛中脫色48～72h，乳酚油作浮載劑制片，鏡檢。

1.5 葉片組織中菌絲體觀察

參考Eckhard［13］的方法將葉盤置于臺盼藍乳酚油混合液中加熱煮沸約1 min，將葉盤轉入飽和水合氯醛液中浸泡30min以上，在此期間更換1次飽和水合氯醛液。然后以40%甘油作浮載劑制片，用相差顯微鏡觀察。

1.6 透射電鏡樣品的制備和觀察

透射電鏡樣品的處理參考康振生［14］的方法進行。將葉片剪成小塊，經3%戊二醛和1%四氧化鋨雙固定，系列乙醇脫水，用Epon812樹脂包埋，超薄切片經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，置于JEM－100CX 型透射電鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 接種后葉片組織的變化

整葉透明結果顯示，接種后24h，抗病品種LBr－12葉片在侵染點出現3～4 個細胞褐色壞死，即表現為過敏性反應（hypersensitive response，HR）（圖1，A）。而感病品種費烏瑞它葉片在接種后24h可觀察到侵染點及其相鄰的細胞沒有出現壞死，而是表現為細胞顏色加深，即為深綠色，且呈浸潤狀分布（圖1，B）。接種48h后，2個品種葉片的病斑都進一步擴大，但抗病品種上擴展的速度明顯小于感病品種（圖1，C、D）?？共∑贩N出現褐色的小病斑，而感病品種則出現水漬狀深綠色病斑。

2.2 接種后葉片組織中菌絲體的觀察

臺盼藍染色和水合氯醛脫色后觀察結果顯示，接種后24h，病原菌只侵染少量LBr－12細胞，胞間菌絲被限制在幾個細胞間，即受到過敏性壞死限制（圖1，E），而胞間菌絲在費烏瑞它葉片細胞間迅速擴展，且產生多個分支（圖1，F）。接種48h 后，LBr－12葉肉細胞侵染的數量增加，侵染點周圍細胞表現為臺盼藍染色加深，出現細胞死亡的跡象（圖1，G）。隨著時間的推移，費烏瑞它接種72h后，胞間菌絲在寄主葉片組織中快速擴展，且產生的較多分支（圖1，H）。

2.3 馬鈴薯與致病疫霉互作的超微結構變化

圖1 馬鈴薯葉片組織中致病疫霉的顯微觀察Fig.1 Observation of P.infestans in the potato leaves after staining using microscope

2.3.1 胞間菌絲體的變化 在接種后24h，感病品種費烏瑞它中可觀察到大量發(fā)育良好的菌絲細胞在感病品種細胞間隙擴展，具有多個細胞核，菌絲細胞線粒體、內質網等細胞器以及核膜、核仁以及染色質清晰可見（圖2，A）；抗病品種LBr－12 在接種后24h，胞間菌絲的形態(tài)基本正常，但液泡增多（圖2，B）。接種36h 后，費烏瑞它中胞間菌絲細胞器正常，液泡增大（圖2，C），抗病品種LBr－12胞間菌絲的細胞原生質的電子致密度加深，液泡增多，菌絲細胞中的線粒體、內質網等細胞器泡囊化，并融合形成大量泡狀物（圖2，D）。LBr－12 中同時可見泡狀物與菌絲細胞質膜融和而沉積到菌絲壁上，使得菌絲細胞壁加厚，細胞質開始紊亂，線粒體腫脹，菌絲質膜和核膜變得模糊，有大量電子致密度高的物質從細胞滲出，菌絲細胞開始畸形壞死或細胞器部分解體，細胞質完全解體或變黑（圖2，E）。隨著時間的推移，LBr－12中泡囊化進一步加劇，細胞器和細胞核變得模糊不清，細胞出現質壁分離，或整個細胞也開始解體（圖2，F、G）。

2.3.2 吸器和吸器母細胞的變化 電鏡觀察發(fā)現，接種后48h，在抗性品種上病菌的吸器外間質加寬，并有電子致密物質沉積，即形成吸器鞘（圖版Ⅰ，1）。少數吸器畸形，吸器壁加厚，原生質染色加深，吸器扭曲和外間質膜形態(tài)異常、發(fā)育受抑或出現吸器質壁分離（圖版Ⅰ，2）。根據吸器發(fā)育受抑的程度和吸器畸形的特點，可將吸器受抑的類型分為兩類。一類為吸器發(fā)育早期受抑型，吸器體一般不能正常膨大，僅產生一些不規(guī)則的分枝而呈畸形（圖版Ⅰ，3）；另一類為吸器發(fā)育后期受抑，初形成的吸器形態(tài)和結構正常，但進一步發(fā)育后，吸器內出現一系列的異常變化。包括吸器質膜與細胞核質膜電子致密度加深，原生質內液泡增多且逐漸增大，線粒體腫大破裂和吸器外間質不規(guī)則加寬并出現致密度深的物質，吸器內的細胞器壞死。在吸器生長受阻和壞死過程中，吸器外間質加寬，產生電子致密的顆粒狀物（圖版Ⅰ，4～6）。

2.3.3 寄主細胞結構的變化 當致病疫霉侵染不同抗病品種后，寄主細胞的反應較為復雜，其抗病反應主要涉及寄主細胞新的防衛(wèi)結構的形成和寄主細胞的過敏性壞死反應。水平抗性品種受侵染后，細胞壁染色加深以及沉積物的產生，對于增強細胞壁機械強度，限制病原菌擴展，具有較強的抵抗作用。電鏡觀察發(fā)現，抗病品種寄主細胞膜內側產生抗侵入的乳突狀結構（圖版Ⅰ，7），為抵抗病菌的進一步擴展，寄主細胞壁和細胞膜極度增厚（圖版Ⅰ，8、9），而感病品種在入侵部位未見乳突狀結構。

圖2 馬鈴薯葉片中致病疫霉菌絲的超微結構Fig.2 Ultrastructure of hyphae of P.infestans in potato leaves

3 討 論

水平抗性品種雖然其反應型表現為中抗，但相對于感病品種，卻表現為病原菌擴展緩慢、病斑較小、產量損失較小等特點。這種抗病性在生產實踐中具有重要的應用價值。水平抗病性機制相當復雜，至今尚未得出一致的觀點。本研究表明，其主要組織細胞學機制表現為寄主葉肉細胞過敏性壞死（即HR反應），被侵染的細胞可產生HR反應，病菌被限制在侵染點的幾個細胞中。與感病品種相比，抗病品種中菌絲產生的分支和吸器較少，病菌的擴展受到抑制。在細胞水平，抗病寄主植物產生細胞壁沉積物，使細胞壁增厚，或在病菌的入侵處產生乳突狀結構來阻止病菌的侵入；另外通過細胞壁在吸器鞘產生沉積物，使病菌的吸器外間質加寬，產生纖維狀或顆粒狀物電子致密物質［15］，使吸器的功能受到影響。

過敏性反應是寄主植物最典型的抗病性機制。研究表明［16］，在超微結構上，無論是水平抗性還是垂直抗病性，其過敏性反應的細胞學死亡過程是一致的。Kowalski等［17］在亞麻銹病中將這種數量性狀抗病性的過敏性反應，稱之為“不完全過敏性反應”（incomplete hypersensitivity），它在侵染過程的晚期表達，而且僅出現在部分受侵細胞中，他認為不同類型抗病性發(fā)生過敏性反應的本質是一樣的。Vleeshouwers等［18］研究顯示，不同馬鈴薯品種出現HR 反應的時間差別顯著，從參與HR 反應的細胞數目看，抗性水平與HR 效率存在相關性。水平抗性與垂直抗病性的主要區(qū)別是，HR 反應出現時間和程度的差異，表現為效率較低的HR。他認為這可能由于弱化的R 基因對病菌激發(fā)子識別緩慢或識別能力不足造成的，這表明在致病疫霉與馬鈴薯互作體系中，過敏性壞死反應是水平抗性馬鈴薯抗晚疫病的重要機制之一。

植物細胞受到病原菌侵染時會出現細胞壁沉積物，使細胞壁增厚，這被認為是植物抵抗病菌的重要防衛(wèi)反應之一［19］。Coffey等［20］對抗病馬鈴薯組織的超微結構觀察表明，感病互作中寄主的細胞壁缺乏胼胝質的積累，而在抗病互作中，進入細胞的吸器周圍沉積大量次生產物，形成一個鞘狀包被，將吸器與寄主細胞的細胞質隔開，使菌絲擴展受到抑制。蔣選利等［21］采用細胞化學方法就對小麥與銹菌互作中胞壁沉積物進行分析，抗病品種中過氧化物酶的活性在侵染點細胞以及遠離侵染點的葉肉細胞壁和細胞間隙中均顯著升高。這些物質不僅可以作為抵抗病菌侵入的機械屏障，而且可以激活防御酶類，提高寄主細胞的抵抗能力。因此，細胞壁沉積物的產生可能是馬鈴薯抗晚疫病的結構防衛(wèi)反應之一。

除此之外，寄主植物還有其它類型的防衛(wèi)反應，如在病菌入侵部位及寄主細胞內側出現抗侵入的乳突狀結構，寄主細胞的壞死頻率較低，能在一定程度上阻止病菌的擴展。病菌的吸器外間質加寬，出現大量電子致密物沉積。這些超微結構在小麥和銹菌的抗病性互作的報道較多［19，20，22］，但其結構和功能還有待進一步研究。

圖版Ⅰ 致病疫霉吸器和LBr－12細胞超微結構PlateⅠ Ultrastructures of P.infestans haustorium and LBr－12cells

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