關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及其雄配子體發(fā)育研究

樸 錦，具紅光，樸鐘云

（1 延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，沈陽110161）

關(guān)蒼術(shù)（AtractylodesjaponicaKoidz.ex Kitam）屬菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物，主產(chǎn)于中國的東北，是吉林省的道地藥材［1］，具有燥濕健胃、祛風(fēng)濕、明目等功效，能治濕困脾胃、倦怠嗜臥、胸痞腹脹、食欲不振、肢節(jié)酸痛、夜盲等疾?。?］。國內(nèi)外對關(guān)蒼術(shù)的研究主要集中在化學(xué)成分［3－4］、藥理活性［5］、炮制方法［6］及環(huán)境因子的影響［7］等方面，對于關(guān)蒼術(shù)的細(xì)胞學(xué)研究較少，僅見于王臣［8］、張定成［9］和李俊英［10］的核型分析報道，而關(guān)于關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂方面的研究鮮有報道。因此，本研究對關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及雄配子體發(fā)育過程進行細(xì)致觀察，以期揭示減數(shù)分裂過程中染色體變化的行為規(guī)律，為關(guān)蒼術(shù)個體世代之間遺傳物質(zhì)的恒定性、遺傳變異規(guī)律、生殖發(fā)育過程等細(xì)胞遺傳學(xué)的深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗材料為菊科蒼術(shù)屬的關(guān)蒼術(shù)，取自延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院關(guān)蒼術(shù)種質(zhì)資源圃。

1.2 實驗方法

于2014年6月17日早晨6：00～9：00，每隔30 min摘取一次正在生長的不同大小的關(guān)蒼術(shù)花蕾。采集后立即放入卡諾氏固定液（冰乙酸∶無水乙醇＝3∶1）中固定24h，經(jīng)95%、80%乙醇各浸泡30min，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

制片時取出花蕾，用游標(biāo)卡尺測量其直徑后放在載玻片中央，用解剖針挑出3～5枚花藥，滴1～2滴卡寶品紅于花藥上，用解剖針將花藥橫向切斷，并從一端向切口輕輕擠壓花藥擠出花粉母細(xì)胞，然后用鑷子除盡花藥壁等雜物，蓋上蓋玻片。吸除多余染色液后烤片，然后立即用濾紙蓋住，用大拇指輕壓蓋片。鏡檢并將好的片子用中性樹膠封片并攝影。

觀察同花蕾和花藥中減數(shù)分裂進程，并拍照保存；分析花蕾大小與減數(shù)分裂進程的關(guān)系，并統(tǒng)計減數(shù)分裂進程中花粉母細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)異常（如雙核仁、落后染色體、染色體橋、染色體片段、微核以及多分體等）情況的頻率。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)蒼術(shù)花蕾形態(tài)與減數(shù)分裂的關(guān)系

關(guān)蒼術(shù)花由許多管狀小花構(gòu)成頭狀花序，花序外圍有一輪葉狀苞片，總苞片5～8 層（圖1，a、b），花瓣為白色（圖1，c），5 枚連合，子房2心皮下位，花柱1條，伸于花藥管中，頂端柱頭2裂。關(guān)蒼術(shù)兩性花、雌花異株，兩性花具有聚藥雄蕊（圖1，d、e），開花后能看見淡紫色的花藥，而雌花中則看不到花藥，剝除花瓣后即可看到相互分離的花絲和花藥，但其花藥全部干癟不產(chǎn)花粉（圖1，f）。

減數(shù)分裂過程與花蕾直徑存在一定相關(guān)性，花蕾直徑約4～5mm 時，關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞進入減數(shù)分裂時期，當(dāng)直徑超過約12 mm，減數(shù)分裂已基本結(jié)束（表1）。同時還發(fā)現(xiàn)同一花蕾中不同花藥，甚至同一花藥內(nèi)不同花粉母細(xì)胞間也存在減數(shù)分裂進程的不同步性（圖1，g～k）。

2.2 關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

共觀察前期Ⅰ至四分體時期的1155個細(xì)胞，其中異常率為7.71%（表2）。減數(shù)分裂各個時期的主要特征如下：

觀察處于前期Ⅰ的299 個細(xì)胞，減數(shù)分裂正常細(xì)胞有294個。處于前期Ⅰ的細(xì)胞染色體行為具有如下特點：細(xì)線期，核內(nèi)出現(xiàn)細(xì)長如線的染色體，相互緊密纏繞位于細(xì)胞一側(cè)（圖版Ⅰ，1）；偶線期，染色體較細(xì)線期縮短增粗，同源染色體開始聯(lián)會，位于細(xì)胞中央（圖版Ⅰ，2）；粗線期染色體進一步短縮加粗，1.68%的粗線期細(xì)胞出現(xiàn)2個核仁（圖版Ⅰ，3、4）；雙線期染色體螺旋化，縮短變粗，染色體現(xiàn)出“V”、“X”、“O”型等形狀（圖版Ⅰ，5）；終變期染色體更加粗短，形成12對較規(guī)則的二價體，多以棒狀、點狀等形式存在（圖版Ⅰ，6），此期二價體在核內(nèi)均勻分散排列，是核內(nèi)染色體計數(shù)的好時期，關(guān)蒼術(shù)染色體構(gòu)型為2n＝14Ⅱ。

中期Ⅰ，核仁消失，二價體排列在赤道板兩側(cè)（圖版Ⅰ，7～9），是鑒定染色體數(shù)目的最好時期（圖版Ⅰ，7），13.34%細(xì)胞存在落后染色體（圖版Ⅰ，10）。

表1 關(guān)蒼術(shù)減數(shù)分裂時期和花蕾直徑的關(guān)系Table1 The relationship between several periods of meiosis and diameter of floral bud of A.japonica

圖1 關(guān)蒼術(shù)花蕾、雄蕊及同一花藥不同時期的減數(shù)分裂相（標(biāo)尺＝12μm）Fig.1 Meiosis－related A.japonica buds，stamens and anthers at different times in the same anther（Bar＝12μm）

表2 減數(shù)分裂各時期花粉母細(xì)胞數(shù)量及染色體異常頻率Table2 Number and frequency of pollen mother cells in each stage of meiosis

后期Ⅰ，在紡錘絲的牽引下，二價體中的兩條同源染色體彼此分離（圖版Ⅰ，11、12），隨機向兩極移動，完成染色體數(shù)目減半（圖版Ⅰ，13）。此期4.20%的細(xì)胞出現(xiàn)染色體橋（圖版Ⅰ，14）和落后染色體（圖版Ⅰ，15）。

末期Ⅰ，染色體移到細(xì)胞兩極后，松散變細(xì)，逐漸形成兩個子核，核仁和核膜重新出現(xiàn)（圖版Ⅰ，16）。此期2.42%的細(xì)胞存在分裂不同步現(xiàn)象（圖版Ⅰ，17）。

前期Ⅱ，染色體散亂分布，逐漸縮短（圖版Ⅰ，18）。

中期Ⅱ，兩組染色體分別排列在各自的赤道板上（圖版Ⅰ，19），4.00%的細(xì)胞出現(xiàn)落后染色體（圖版Ⅰ，20）或產(chǎn)生染色體不同步的現(xiàn)象（圖版Ⅰ，21）。

后期Ⅱ，姊妹染色單體在紡錘絲的作用下分別移向兩極（圖版Ⅰ，22），其中有81.99%的細(xì)胞染色體能正常分向兩極，有18.02% 的細(xì)胞出現(xiàn)染色體橋（圖版Ⅰ，23）或產(chǎn)生染色體不同步的現(xiàn)象（圖版Ⅰ，24、25）。

末期Ⅱ，到達(dá)兩極的四組子染色體解螺旋，濃縮成團，核仁出現(xiàn)，核膜形成，1 個母細(xì)胞分裂成4個子細(xì)胞（圖版Ⅰ，26），至此減數(shù)分裂結(jié)束，進入四分體時期。

四分體時期，染色體到達(dá)四極，解螺旋，形成隔壁分為四分體，其四分體結(jié)構(gòu)少數(shù)為十字型或環(huán)型（圖版Ⅰ，27），多為四面體型（圖版Ⅰ，28）。此期表現(xiàn)極為復(fù)雜，正常四分體占85.14%，染色體融合（圖版Ⅰ，29、30）、三分體（圖版Ⅰ，31）、五分體（圖版Ⅰ，32）、六 分 體（圖 版Ⅰ，33）等 異 常 現(xiàn) 象 共 占14.87%。隨后，小孢子相互分離，形成4個單核花粉粒（圖版Ⅰ，34），也存在部分花粉粒未能正常發(fā)育的現(xiàn)象（圖版Ⅰ，35）。

2.3 關(guān)蒼術(shù)雄配子體的發(fā)育

關(guān)蒼術(shù)小孢子（單核花粒）初期細(xì)胞壁薄，細(xì)胞質(zhì)濃，核位于細(xì)胞的中央（圖版Ⅱ，a）。單核花粉粒不斷從周圍吸取絨氈層的分泌物或其降解物，體積增大，柱狀結(jié)構(gòu)上沉積孢粉素，形成花粉外壁（圖版Ⅱ，b），細(xì)胞質(zhì)明顯液泡化，逐漸形成中央大液泡，細(xì)胞核被擠向與花粉粒壁的一側(cè)，進入單核靠邊期（圖版Ⅱ，c、d）；此后，細(xì)胞核在近壁處不均等分裂（圖版Ⅱ，e），形成不同形狀的兩個細(xì)胞，圓形狀靠近液泡的即為營養(yǎng)細(xì)胞，弧形狀靠近花粉粒壁的為生殖細(xì)胞（圖版Ⅱ，f、g）；生殖細(xì)胞漸漸伸長，呈紡錘形，再進行1次有絲分裂，形成兩個精細(xì)胞，成為3－細(xì)胞型花粉粒（圖版Ⅱ，h、i）。關(guān)蒼術(shù)花粉形成外壁時，有些地方?jīng)]有積累壁物質(zhì)而留有空隙，這些空隙逐漸發(fā)育成萌發(fā)溝（圖版Ⅱ，g），花粉在柱頭上萌發(fā)時花粉管即從此處伸出。

3 討 論

3.1 關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察的最佳時期

關(guān)蒼術(shù)減數(shù)分裂的染色體行為在同一花蕾和花藥間均表現(xiàn)出不同步性，特別是花蕾外圍小花的花藥和內(nèi)部小花的花藥間差異明顯。這種不同步性可以延長關(guān)蒼術(shù)的花期，避免外部環(huán)境（如陰雨、低溫）對散粉的影響而增加授粉幾率，對其種群繁殖有利，是一種適應(yīng)環(huán)境條件的進化表現(xiàn)［11］。關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時期與花蕾大小緊密相關(guān)，在花蕾大小為4～12mm 時取樣，可初步判斷其進入減數(shù)分裂時期，若想掌握花藥的減數(shù)分裂時期，可以此作為取材依據(jù)。

3.2 關(guān)蒼術(shù)減數(shù)分裂異常的原因及其與花粉敗育的關(guān)系

3.2.1 染色體橋 后期染色體橋是最常見的染色體異?，F(xiàn)象，可以作為鑒定是否出現(xiàn)染色體倒位的依據(jù)之一［12］。在關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的后期Ⅰ和后期Ⅱ均產(chǎn)生染色體單體橋，其原因可能是在倒位圈內(nèi)外，非姊妹染色單體之間發(fā)生交換，其結(jié)果產(chǎn)生雙著絲點染色單體。此雙著絲粒在后期向相反的兩級移動時，兩個著絲粒之間的區(qū)段跨越兩級構(gòu)成后期橋。凡是含有因交換而產(chǎn)生重復(fù)－缺失染色體的四分孢子都是敗育的，因此，關(guān)蒼術(shù)也存在花粉部分?jǐn)∮默F(xiàn)象。

3.2.2 落后染色體 關(guān)蒼術(shù)染色體制片中還發(fā)現(xiàn)染色體小片段和落后染色體。落后染色體是由于分裂的細(xì)胞受到損傷（多半是由于紡錘體被破壞），引起染色體不同步移動或者不移動而造成的，本試驗中多見于分裂中期Ⅱ和后期Ⅱ，這種現(xiàn)象有可能導(dǎo)致關(guān)蒼術(shù)染色體數(shù)目的丟失從而造成部分花粉的敗育。

3.2.3 不均等分離 正常進入減數(shù)分裂的細(xì)胞在四分體時期有明顯的四個均大的小孢子，被胼胝質(zhì)壁所包裹，而異常的小孢子母細(xì)胞在形成四分體時產(chǎn)生不均等分離而產(chǎn)生三分體、五分體或多分體。這種不均等分離的原因可能有以下原因，一是有的二價體不發(fā)生分離，移向同一級；二是單價體的隨機分配；三是發(fā)生倒位的雙著絲點染色體被拉向同一級。不均等分離引起的遺傳物質(zhì)的減少或增加最終導(dǎo)致配子體不育［13］。

3.2.4 減數(shù)分裂不同步 關(guān)蒼術(shù)花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂末期Ⅰ和中期Ⅱ到達(dá)兩級的染色體發(fā)生不同步的現(xiàn)象，其原因可能是部分花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂某一時期發(fā)生停滯或推遲造成的，花粉母細(xì)胞發(fā)育雖不同步，但最后均完成減數(shù)分裂形成花粉粒。劉麗琴［14］等也認(rèn)為減數(shù)分裂過程中發(fā)生的染色體橋、落后染色體、染色體片段及多分孢子等異常現(xiàn)象與減數(shù)分裂的不同步?jīng)]有直接的關(guān)系。

減數(shù)分裂過程中發(fā)生的染色體橋、落后染色體、染色體片段及多分孢子等異常現(xiàn)象，會不同程度地導(dǎo)致小孢子中遺傳物質(zhì)的不均衡而形成沒有育性的

孢子，是造成花粉育性低的重要原因［15］。我們曾采用蔗糖培養(yǎng)法對關(guān)蒼術(shù)花粉的育性檢測，發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度為15%，培養(yǎng)溫度25℃時，敗育率為19.6%［16］，其花粉敗育率和減數(shù)分裂后期的異常行為比率接近，說明花粉敗育應(yīng)該有一定的細(xì)胞學(xué)原因。導(dǎo)致花粉敗育的原因是多方面的，除了細(xì)胞學(xué)原因，還可能與絨氈層細(xì)胞的作用失常、營養(yǎng)不良及外界環(huán)境等有關(guān)，具體原因有待于進一步研究。

圖版Ⅰ 關(guān)蒼術(shù)（兩性花）花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及異常情況（標(biāo)尺＝12μm）PlateⅠ The Meiosis process of pollen mother cells and abnormal conditions of A.japonica（bisexual flower）（Bar＝12μm）

圖版Ⅱ 關(guān)蒼術(shù)花粉粒發(fā)育過程（標(biāo)尺＝12μm）PlateⅡ Microdiode development of A.japonica（Bar＝12μm）

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