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    用cre-loxp鼠研究Runx2在釉質發(fā)育中的作用

    2016-06-15 17:13:29徐海春徐曉東
    中國醫(yī)療美容 2016年8期
    關鍵詞:條件性純合子合子

    徐海春,王 偉,徐曉東▲

    (1上海市黃浦區(qū)半淞園社區(qū)衛(wèi)生服務中心口腔科, 上海 200011;2.上海市同仁醫(yī)院口腔科, 上海 200336)

    用cre-loxp鼠研究Runx2在釉質發(fā)育中的作用

    徐海春1,王 偉2,徐曉東2▲

    (1上海市黃浦區(qū)半淞園社區(qū)衛(wèi)生服務中心口腔科, 上海 200011;2.上海市同仁醫(yī)院口腔科, 上海 200336)

    目的 為研究Runx2基因缺失對牙釉質發(fā)育的影響,擬建立Runx2基因條件性敲除的小鼠動物模型。方法 利用染色體位點特異性重組酶cre-loxp系統(tǒng)和FLP-frt的條件性基因打靶,借助于同源重組將兩個同向的loxp位點置于Runx2基因的編碼重要功能域外顯子2兩側的內含子序列中,從而獲得表型正常的Flox小鼠,為了提高ES細胞篩選的效率,插入被FRT位點瞄定的、作為選擇性篩選的陽性標記neo基因,同時插入作為負性篩選的DTA,通過電轉的方式,將構建成功的載體電導入到ES細胞,并通過對中靶的ES細胞進行篩選和鑒定,得到了同源重組正確的陽性克隆,通過顯微注射,將中靶的ES細胞導入囊胚中,將囊胚移植到代孕鼠子宮內,最終得到嵌合體小鼠,將此嵌合體小鼠與FLP工具鼠雜交,利用FRT與FLP特異性識別,去掉neo基因即可獲得陽性的loxp鼠,將其與組織特異性表達cre重組酶的轉基因小鼠雜交,特異性表達的cre重組酶將介導loxp位點間的基因片段重組。小鼠出生后經(jīng)PCR鑒別,獲得Runx2基因條件性敲除的雜合子小鼠,條件性敲除的雜合子小鼠自交或與loxp純合子小鼠雜交,小鼠出生后,PCR鑒別篩選條件性完全敲除的小鼠。RT-PCR法檢測外源性Cre基因的表達。結果 構建了cre鼠、loxp鼠和Runx2基因條件性敲除的小鼠模型。結論 利用染色體位點特異性重組酶loxp-cre系統(tǒng)和FLP-frt系統(tǒng)可以很好的研究Runx2基因缺失對牙釉質發(fā)育的影響。

    cre-loxp系統(tǒng);Runx2;基因打靶;同源重組;FLP-frt系統(tǒng)

    牙釉質對牙齒的生理功能具有重要的意義。牙釉質發(fā)育離不開各種轉錄因子的作用。Runx2作為成骨細胞分化的特異性轉錄因子,在牙胚發(fā)育中具有重要作用,參與牙齒萌出時的牙槽骨改建過程,對牙周膜起重要作用[1]。有文獻表明[2],Runx2可通過介導TGF-β1來調節(jié)成釉細胞基質金屬蛋白酶基因(MMP20)的表達。為了進一步研究Runx2在牙釉質發(fā)育中的作用,我們利用染色體位點特異性重組酶cre-loxp系統(tǒng),構建了Runx2基因條件性敲除的小鼠動物模型,為以后研究Runx2基因介導TGF-β1調控釉質的發(fā)育奠定了基礎。

    1 材 料 與 方 法

    1.1 實驗動物和儀器設備、主要材料

    C57BL/6背景的小鼠(廣州賽業(yè))PCR儀(Bio-RAD7100)電泳儀(北京君意JY200C)凝膠成像系統(tǒng)(北京賽智CHampGe15500)2×Easy Taq PCR Super Mix(TRAN,北京全式金) RNAiso Plus(TaKaRa,大連寶生物)Agarose-Molecular Biology Grade(invitrogen75510-019, 美國)DL-500DNA Marker(TaKaRa,大連寶生物)

    1.2 實驗方法和步驟

    1.2.1 RUNX2loxp/loxp動物模型的構建

    Runx2基因位于17號染色體上,根據(jù)對其基因序列的研究,符合條件性敲除Runx2基因的條件,在其基因序列上共含7個外顯子,ATG作為起始密碼子,位于外顯子1,TGA作為終止密碼子,位于外顯子7。RUNX2loxp/loxp在胚胎干細胞中通過同源重組獲得,選擇在編碼Runx2的外顯子2的兩端插入兩個方向相同的loxp位點。為提高ES細胞篩選效率,插入作為陽性篩選、被FRT位點瞄定的neo基因,同時插入作為負篩選標記基因DTA,載體構建成功(如圖1所示)后,通過電轉方式,導入到ES細胞,并通過對中靶的ES細胞進行正負雙向篩選和鑒定,得到同源重組正確的陽性克隆。通過顯微注射,將中靶的ES細胞導入囊胚中,將囊胚移植到代孕鼠子宮內,最終得到嵌合體flox小鼠,將此嵌合體小鼠和與FLP工具鼠雜交,利用FRT與FLP特異性識別,去掉neo基因即可獲得被loxp位點瞄定的Runx2小鼠。刪除兩個同向loxp位點間的外顯子2的序列,引起外顯子2下游的移碼突變,這樣就獲得了Runx2缺失的條件性基因敲除的小鼠動物模型。

    1.2.2 pRP.ExSi-Amelogenin-cre動物模型的構建

    以噬菌體P1基因組DNA為模板,用上下游引物擴增出片段長1032bp的Cre,其大小與GenBank報道的片段大小相符。以其構建的pcDNA3.1-HisACre經(jīng)EcoRⅠ雙酶切鑒定正確,DNA測序經(jīng)BLAST顯示與預期結果一致。利用GatewayTechnology構建pRP.ExSi-Amelogenin-cre啟動子(如圖2所示),將其經(jīng)單酶切線性化后通過瓊脂糖凝膠電泳(10g/ L),用QIAquick Gel ExtractionKit 回收產(chǎn)物,然后把其溶解在滅菌的 5 mmol /L Tris,pH7.4,0.2 mmol /L EDTA顯微注射DNA 緩沖液中; 最后把線性化DNA 通過原核注射的方式注射于400個受精卵; 顯微注射后的受精卵回送10只C57BL/6代孕母鼠輸卵管中,受孕后出生小鼠經(jīng)PCR鑒定后,即可得到轉基因小鼠。

    1.2.3 基因敲除小鼠的構建

    由于Cre重組酶能特異性的識別loxp位點,將組織特異性Cre小鼠與去掉FRT位點的loxp鼠雜交,特異性表達的cre重組酶介導loxp位點間的基因片段重組,根據(jù)孟德爾遺傳定律,cre雜合子小鼠與Flox純合子小鼠雜交,小鼠出生后,經(jīng)PCR鑒定,即可獲得Runx2條件性敲除的雜合子小鼠模型,利用此雜合子小鼠自交或者此雜合子小鼠和Flox純合子小鼠雜交,根據(jù)孟德爾遺傳定律,小鼠出生后,經(jīng)PCR鑒別篩選loxp純合子同時表達cre重組酶的小鼠即為所需的Runx2條件性敲除的純合子模型。

    1.2.4 PCR鑒別篩選轉基因鼠

    從鼠尾提取基因組DNA,通過相應的引物利用PCR儀來鑒別篩選轉基因鼠。PCR反應條件:94℃5min,94℃ 30s,59℃ 30s,72℃ 20s,30個循環(huán)后72℃延伸5min,1mg/50ml的瓊脂糖凝膠電泳。PCR鑒別轉基因鼠的特異性引物:

    鑒別Loxp(圖3):

    F: GGCGCCTTGTTAGAGTGGTGCCTT

    R: CCTTGTGCCAGGTTAGCTGTGC

    (純合子:309bp 雜合子:248bp/309bp 野生型:248bp)

    鑒別Frt和Loxp(圖4):

    BZMC001_Neo_Del F: GGGGGTTTAGCACGTACAGTAGGG

    BZMC001_Neo_Del R: CTCCAACTGTCCCTGTATGAACGC

    (純合子:308bp 雜合子:168bp/308bp 野生型:168bp)

    鑒定Cre鼠(圖5)的特異性引物:

    F: CCAGCTAAACATGCTTCATCGTC

    R: TGATCCTGGCAATTTCGGCTA

    Internal control F:ACTCCAAGGCCACTTATCATT

    Internal control R:ATTGTTACCAACTGGACGACA

    目的片段:263bp,Internal control 片段:413bp)Cre鼠的鑒別只有一條目的條帶,因此不能區(qū)分純合子還是雜合子。

    Runx2基因條件性敲除的小鼠鑒別篩選:利用cre重組酶表達陽性的小鼠和Flox純合子小鼠雜交,小鼠出生后,分別利用鑒別cre鼠的引物和loxp鼠的引物來篩選,F(xiàn)1代篩選出Flox雜合子同時cre重組酶表達陽性的小鼠(圖6),然后利用這些小鼠雌雄自交,或者再分別和Flox純合子小鼠交配,小鼠出生后,經(jīng)PCR鑒別篩選出Flox純合子同時cre重組酶陽性的小鼠(圖7),此小鼠即為我們所需的Runx2基因條件性敲除的純合子小鼠模型。

    2 RT-PCR檢測外源性Cre基因在小鼠頜骨的表達

    利用Trizol法提取出生5d的Cre陽性小鼠和WT鼠的下頜骨磨牙區(qū)的RNA。參考Reverse Transcriptase M-MLV逆轉錄1ug總RNA為cDNA。以此cDNA為模板,GAPDH作為內參,以P1:CGACCAGGTTCGTTCACTCA

    P2:CAGCGTTTTCGTTCTGCCAA(184bp) 作 為引物,用RT-PCR分別檢測mCre在Cre陽性小鼠和WT小鼠下頜骨的表達。聚合酶鏈式反應條件:94℃ 5min,94℃ 30s,59℃ 30s,72℃ 20s,30個循環(huán)后72℃延伸5min,1mg/50ml的瓊脂糖凝膠電泳(圖8)。

    3 結 果

    成功構建Flox鼠和組織特異性表達的cre鼠,通過Flox鼠和組織特異性表達的cre鼠的雜交得到了Runx2條件性完全敲除的小鼠模型。

    提取cre陽性小鼠和WT小鼠總RNA,利用cre特異性引物,gapdh作內參,只能在cre陽性小鼠模板中擴增出陽性條帶

    圖1 BZMCOO1-mRunx2載體構建圖譜

    圖2 amelx-cre基因表達載體構建圖譜

    圖3

    圖4

    圖5 cre陽性小鼠為第15、17、19號

    圖6 (1)為cre陽性小鼠與loxp純合子小鼠雜交,所生小鼠用鑒別cre鼠的引物和Internal control引物來篩選cre陽性的小鼠,其中3,4,5,7,10為cre陽性小鼠

    圖6 (2)為cre鼠與loxp純合子小鼠雜交,所生小鼠用鑒別loxp的引物來篩選,均為loxp雜合子。

    圖7 (1)為loxp雜合子同時cre陽性的小鼠雜交所生小鼠,用鑒別cre鼠的引物篩選,陽性小鼠為1,2,3,5,6號

    圖7 (2)為loxp雜合子同時cre陽性的小鼠雜交所生小鼠,用鑒別loxp鼠的引物篩選,純合子為1,3,5號,雜合子為6,7野生型為2,4號

    圖8 (1) cre特異性引物

    圖8 (2) GAPDH

    4 討 論

    Runx2屬于Runt家族中的成員,是一種調節(jié)成骨細胞分化的轉錄因子。Runx2在骨骼形成和發(fā)育中起著重要的作用。有文獻表明,Runx2基因的移碼突變與顱骨鎖骨發(fā)育不全有密切的關系[4]。但是關于其具體的作用機制尚不清楚。Runx2基因廣泛參與牙齒發(fā)育中各組織的形成和發(fā)育[5]。因此,研究Runx2基因對牙齒發(fā)育的影響機制具有重要的意義。

    轉基因動物模型越來越多的運用在生命科學的基礎研究,為我們研究生命科學提供了重要的手段。小鼠與人類的基因序列具有高度的同源性,因此我們采用小鼠的動物模型來研究人類的生命科學現(xiàn)象。利用動物模型研究生命科學現(xiàn)象有其自身的局限性。轉基因動物的胚胎致死性是影響我們實驗研究的主要問題,某些重要基因的完全性敲除可引起轉基因動物的胚胎致死性,限制了我們對其的進一步研究。Cre-loxp系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn),很好的解決了這一難題。Cre-loxp系統(tǒng)利用特異性的啟動子啟動cre重組酶在特定的時間特定的組織特異性表達,使在特定的時間空間上對特定基因研究成為了可能。Runx2在牙齒和骨骼的發(fā)育中具有重要的作用[6]。缺乏Runx2基因的小鼠在出生時就死亡,沒有骨和牙齒的發(fā)育[7]。Runx2基因位于17號染色體上,根據(jù)對其基因序列的研究,符合條件性敲除Runx2基因的條件,在其基因序列上共含7個外顯子,ATG作為起始密碼子,位于外顯子1,TGA作為終止密碼子,位于外顯子7。我們選擇外顯子2作為條件性敲除的位點,在Runx2的外顯子2兩端的內含子內插入兩個loxp位點,從而獲得表型正常的Flox小鼠,為了提高ES細胞篩選的效率,插入作為選擇性篩選的陽性標記neo基因和負篩選標記基因DTA,將構建成功的載體導入到ES細胞,并通過對中靶的ES細胞進行雙向篩選和鑒定,得到了同源重組正確的陽性克隆,通過顯微注射,將中靶的ES細胞導入囊胚中,將囊胚移植到代孕鼠子宮內,最終得到嵌合體Flox小鼠,將此嵌合體小鼠和與FLP工具鼠雜交,利用FRT與FLP特異性識別,去掉neo基因即可獲得被loxp位點瞄定的Runx2小鼠,將此小鼠與FLP工具鼠雜交,利用FRT與FLP特異性識別,去掉neo基因即可獲得陽性的Flox鼠。構建amelx啟動子特異性啟動cre重組酶表達的轉基因小鼠,通過Flox鼠純合子和組織特異性表達的cre小鼠的雜交,建立creloxp系統(tǒng),組織特異性表達的cre重組酶將介導loxp位點間的基因重組,根據(jù)孟德爾遺傳學定律,小鼠出生后經(jīng)PCR鑒定可獲得特異性基因敲除的雜合子小鼠,利用此同窩的雜合子小鼠交配或者分別和Flox純合子小鼠交配,小鼠出生后,經(jīng)PCR鑒別篩選loxp純合子同時cre重組酶表達陽性的小鼠即為所需純合子條件性完全敲除的小鼠模型。通過對Runx2基因條件性完全除的小鼠模型的觀察,我們可以很好的對Runx2基因對牙齒發(fā)育的影響展開更進一步的研究,對Runx2基因對牙釉質發(fā)育影響的分子機制展開更為深入的探索。

    [1]胡佳藝,李琥,侯偉,等. RUNX家族蛋白在小鼠磨牙發(fā)育過程中的表達分析[J]. 口腔生物醫(yī)學,2012,04:193-196.

    [2]孫學玲,孫巖,張娟娟,等. Runx2介導TGF-β1調控成釉細胞MMP20基因表達的研究[J]. 牙體牙髓牙周病學雜志,2012,02:61-65.

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    徐海春(1978-), 女 ,江蘇南京人,本科,主治醫(yī)師.

    徐曉東(1974-), 男,本科,浙江鄞縣人,副主任醫(yī)師.

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