紫杉醇注射液雜質(zhì)檢查方法建立①

于俊清

摘 要：目的 對有關(guān)物質(zhì)檢查方法篩選，建立紫杉醇注射液有關(guān)物質(zhì)檢查方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Ultimate柱（250mm*4.6mm，5μm），以乙腈：水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，柱溫40℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為230nm。結(jié)果 輔料對有關(guān)物質(zhì)測定無干擾，耐用性試驗(yàn)表明色譜條件微小變化雜質(zhì)檢出基本一致，溶液穩(wěn)定性研究結(jié)果表明溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定，該品檢測限溶液溶度為97ng/mL，專屬性試驗(yàn)結(jié)果表明各條件下降解產(chǎn)物與主峰可有效分離。結(jié)論 梯度洗脫檢查雜質(zhì)更準(zhǔn)確，方法學(xué)試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)符合規(guī)定，可用于該品有關(guān)物質(zhì)檢查。

關(guān)鍵詞：紫杉醇 方法學(xué) 含量測定

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2015）03（b）-0214-01

紫杉醇是紅豆杉屬植物中的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，也是目前所了解的惟一一種可以促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管的藥物。同位素示蹤表明，紫杉醇只結(jié)合到聚合的微管上，不與未聚合的微管蛋白二聚體反應(yīng)。細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管，這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能，特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期，阻斷了細(xì)胞的正常分裂。目前已上市紫杉醇制劑廠家較多，有關(guān)物質(zhì)檢查方法較多，除文獻(xiàn)方法外[1-6]，《中國藥典》2010年版二部收載紫杉醇制劑有關(guān)物質(zhì)檢查方法，通過對各檢查方法比較，發(fā)現(xiàn)色譜條件對雜質(zhì)檢出情況有明顯差別，普通的等度洗脫無法有效檢出全部雜質(zhì)，本文對梯度洗脫方法進(jìn)行優(yōu)化，建立梯度方法檢查本品有關(guān)物質(zhì)，并對方法進(jìn)行詳細(xì)驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

日本島津高效液相色譜儀LC-20A（DAD檢測器），色譜柱Ultimate AQ-C18 5 μm 4.6×250 mm，乙腈為色譜純（Dima），紫杉醇（含量：99.6%，使用前不需干燥，批號：100382-201102）、紫杉醇雜質(zhì)Ⅰ（7-表-10-去乙酰基紫杉醇，批號：100925-201102）、雜質(zhì)Ⅱ紫杉醇雜質(zhì)Ⅱ（7-表-10-去乙?；仙即?，批號：100926-201102）和雜質(zhì)Ⅲ（7-表-紫杉醇，批號：100927-201102）購自中國食品藥品檢定研究院。

紫杉醇注射液由哈藥集團(tuán)生物工程公司提供，乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

分別取紫杉醇、紫杉醇雜質(zhì)對照品、空白輔料、起始物料及中間體，加乙腈使溶解，制成單一溶液及混合溶液，按照文獻(xiàn)方法分別進(jìn)樣，根據(jù)雜質(zhì)檢出及分離情況對方法進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1，紫杉醇與其它物質(zhì)可有效分離，紫杉醇峰純度符合規(guī)定，輔料、中間體及起始物料不干擾含量測定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈：水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為40℃，檢測波長為230 nm。理論塔板數(shù)不低于5000，紫杉醇與雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及雜質(zhì)Ⅲ的分離度應(yīng)符合規(guī)定。

測定法 取該品2.5 mL置10 mL量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，作為對照溶液，精密量取空白輔料溶液2.5 mL于10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，作為空白輔料溶液，精密量取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取紫杉醇對照品、紫杉醇與雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及雜質(zhì)Ⅲ加乙腈使溶解，作為系統(tǒng)適用性溶液，按照擬建立色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及雜質(zhì)Ⅲ與紫杉醇分離度符合規(guī)定。

2.3 耐用性試驗(yàn)

改變柱溫（35℃、4015℃、45℃）、色譜柱（相同品牌不同批號的3根色譜柱）及流速（0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min），評價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)改變對有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果的影響，同時(shí)評價(jià)各色譜條件下系統(tǒng)適用性，結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)變化對有關(guān)物質(zhì)結(jié)果無影響，耐用性試驗(yàn)符合規(guī)定。在各種色譜條件下對稱因子在0.9至1.1之間，塔板數(shù)均大于10000。

2.4 檢測限

取紫杉醇對照品，7-表-10-去乙?；仙即紝φ掌罚?-表-10-去乙?；仙即紝φ掌?，7-表-紫杉醇對照品，制成系列濃度溶液，進(jìn)樣，當(dāng)信噪比約為3：1時(shí)，各進(jìn)樣濃度為檢測限濃度。結(jié)果紫杉醇、7-表-10-去乙酰基紫杉醇、7-表-10-去乙酰基紫杉醇及7-表-紫杉醇檢測限分別為97 ng/mL、86 ng/mL、91 ng/mL、164 ng/mL， 供試品溶液濃度可有效檢出雜質(zhì)。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液，重復(fù)測定6次，結(jié)果6次測定結(jié)果雜質(zhì)Ⅰ、雜質(zhì)Ⅱ及雜質(zhì)Ⅲ與紫杉醇分離度均符合規(guī)定，6次測定有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果一致。重復(fù)性試驗(yàn)符合規(guī)定。

2.6 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液，加乙腈稀釋至刻度，作為供試品溶液；取供試品溶液1.0 mL于50 mL量瓶中加乙腈稀釋至刻度，作為對照品溶液。室溫條件下放置放置8 h，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h及8 h進(jìn)樣。結(jié)果對照溶液峰面積變化的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.26%，保留時(shí)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.41%，符合規(guī)定，供試品溶液放置8 h無新的雜質(zhì)峰產(chǎn)生，各雜質(zhì)峰無明顯變化，供試品溶液及對照品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 專屬性試驗(yàn)

取紫杉醇注射液樣品，對樣品進(jìn)行酸（0.1 mol/mL）、堿（0.1mol/mL）、氧化（30%過氧化氫溶液）、高溫（100℃）及強(qiáng)光（5000LX）破壞試驗(yàn)，使用DAD檢測器，全波長監(jiān)測，考察各種破壞條件下雜質(zhì)檢出情況。結(jié)果230 nm為該品最佳檢測波長，確定供試品檢測波長為230 nm，供試品在各條件下降解產(chǎn)物約為5%，雜質(zhì)與主峰可有效分離，峰純度符合規(guī)定，各破壞條件下物料平衡。說明梯度洗脫方法可行。

上述方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明所建立方法可行，雜質(zhì)與主峰可有效分離。

3 討論

對檢查方法進(jìn)行優(yōu)化，新方法運(yùn)行時(shí)間較長，但優(yōu)化后的雜質(zhì)檢查方法可有效檢出起始物料、中間體及降解產(chǎn)物，主峰與雜質(zhì)峰分離度符合規(guī)定，分離識別效果更優(yōu)。

參考文獻(xiàn)

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