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    靶向VEGF—C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞VEGF—C基因表達(dá)的影響

    2015-07-02 10:09楊輝徐笑紅
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2015年10期
    關(guān)鍵詞:蛋白

    楊輝++++++徐笑紅

    [摘要] 目的 探討靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖、凋亡及化療敏感性的影響。 方法 針對(duì)VEGF-C的siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞,另設(shè)立轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染陰性表達(dá)載體組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。觀察各組細(xì)胞的VEGF-C mRNA及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組VEGF-C mRNA表達(dá)率無(wú)顯著差異(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組各組的表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)A組的表達(dá)又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組(P<0.01)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組培養(yǎng)液上清中VEGF-C蛋白水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組各組蛋白水平均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)A組蛋白水平又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組(P<0.01)。 結(jié)論 靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體能夠顯著降低人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C的基因和蛋白表達(dá)。

    [關(guān)鍵詞] 人乳腺癌細(xì)胞;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C;蛋白

    [中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2015)10-0001-04

    Effect of siRNA expression vector of targeting the VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression

    YANG Hui1 XU Xiaohong2

    1.Cancer Chemotherapy Center, Ningbo Yinzhou People's Hospital, Ningbo 315000, China; 2.Cancer Chemotherapy Center, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China

    [Abstract] Objective To discuss the effect of siRNA expression vector of targeting VEGF-C on breast cancer cells VEGF-C gene expression. Methods The siRNA expression vector of targeting VEGF-C transfected breast cancer cells, and another groups of expression vector transfected and transfected with negative were established. Each group set up five wells. VEGF-C mRNA and protein expression of all groups were compared. Results VEGF-C mRNA expression of negative control group and the control group showed no significant difference (P>0.05). VEGF-C mRNA expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group (P<0.01); expression of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C (P<0.01). VEGF-C protein levels in culture supernatant of negative control group and the control group showed no significant difference(P>0.05); VEGF-C protein levels in culture supernatant of expressions of experimental groups were lower than negative control group and the control group (P<0.01); Level of experimental group A was lower than expressions of experimental group B and C (P<0.01). Conclusion siRNA expression vector of targeting the VEGF-C can apparently decrease VEGF-C mRNA and protein expression on breast cancer cells.

    [Key words] Breast cancer cells; Vascular endothelial growth factor-C; Protein

    乳腺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤,在女性惡性腫瘤的發(fā)病中占首位。手術(shù)治療是根治乳腺癌的主要方法,但是術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、化療耐藥可影響最終的治療效果。近年來(lái)隨著分析生物學(xué)的迅速發(fā)展,分子靶向治療成為新的熱點(diǎn)[1,2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是VEGF家族的成員之一,與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2、3結(jié)合,促進(jìn)血管及淋巴管的增生,參與腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移過(guò)程[3,4]。VEGF-C結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的受體后,能促進(jìn)細(xì)胞的增殖,并能阻止細(xì)胞凋亡,降低腫瘤細(xì)胞的化療敏感性,靶向抑制VEGF-C基因的表達(dá),對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖具有一定的臨床意義。本研究主要探討靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體對(duì)人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料

    實(shí)驗(yàn)研究時(shí)間:2013年4月~2014年12月。MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司。靶向VEGF-C的siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒,陰性對(duì)照質(zhì)粒。主要試劑:培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000、Trizol試劑、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、2×Taq PCR Master Mix、DNA Marker Ⅱ、人VEGF-C ELISA試劑盒、SABC 組化試劑盒、DBA試劑盒、瓊脂糖、DEPC等。主要儀器:CO2恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、核酸蛋白檢測(cè)儀、離心機(jī)、電泳儀、電泳槽、PCR儀、酶標(biāo)儀。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代 乳腺癌細(xì)胞株經(jīng)復(fù)蘇后,接種于培養(yǎng)瓶中,37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng),細(xì)胞80%融合時(shí),進(jìn)行傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞 (1)轉(zhuǎn)染用重組質(zhì)粒DNA純化、定量。質(zhì)粒抽提試劑盒提取靶向VEGF-C重組質(zhì)粒(pRNAT-VEGF-C-1、pRNAT-VEGF-C-2、pRNAT-VEGF-C-3)及陰性對(duì)照質(zhì)粒(P-N)。(2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板,每孔3×105個(gè),培養(yǎng)24 h,細(xì)胞達(dá)到90%融合。分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組:空白對(duì)照組,未轉(zhuǎn)染;陰性對(duì)照組,轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒;實(shí)驗(yàn)A組轉(zhuǎn)染pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒;實(shí)驗(yàn)B組轉(zhuǎn)染pRNAT-VEGF-C-2質(zhì)粒;實(shí)驗(yàn)C組轉(zhuǎn)染pRNAT-VEGF-C-3質(zhì)粒。制備脂質(zhì)體/質(zhì)粒DNA混合物。洗凈培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液,采用DMEM培養(yǎng)液清洗細(xì)胞2遍,加入DMEM培養(yǎng)基500 μL,加入脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物,總體積600 μL。每組5個(gè)復(fù)孔。空白對(duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)基。37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)6 h,換液,加1 mL含10%FCS的DMEM過(guò)夜。

    1.3 檢測(cè)方法

    1.3.1 采用RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中VEGF-C mRNA表達(dá) (1)提取總RNA。(1~5)×106細(xì)胞移入EP管中,離心,去上清。加入Trizol 1 mL混勻,室溫下放置5 min,加入氯仿200 μL,震蕩15 s,室溫下放置3 min。4℃離心15 min,將水相轉(zhuǎn)移到EP管中,加入等體積異丙醇混勻,放置20~30 min,4℃離心10 min,去上清,加75%乙醇1 mL洗滌沉淀。4℃離心5 min,倒出液體再次離心后,槍頭吸出少量液體,留下沉淀。室溫晾干,重復(fù)溶解RNA。4 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。(2)PCR擴(kuò)增。VEGF-C引物和β-actin引物由上海博雅生物公司合成提供。反應(yīng)體系12.5 μL。瓊脂糖點(diǎn)凝膠電泳,分析電泳結(jié)果,VEGF-C表達(dá)率采用其吸光度值與內(nèi)參照β-actin吸光度值比例表示。

    1.3.2 采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF-C蛋白的表達(dá) (1)每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi),37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h,細(xì)胞轉(zhuǎn)染。設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組、實(shí)驗(yàn)C組,同mRNA檢測(cè)。每組5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后48 h,收集上清,采用ELISA法檢測(cè)上清液中的VEGF-C蛋白水平。

    1.3.3 采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的乳腺癌細(xì)胞,每孔3×105個(gè)接種于放有載玻片的培養(yǎng)板內(nèi),37℃,5%CO2培養(yǎng)24 h。細(xì)胞布滿80%后,進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,步驟和分組同上。每組5個(gè)復(fù)孔。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后48 h,取出培養(yǎng)板,吸凈培養(yǎng)液,加甲醛固定,PBS沖洗3遍。取出載玻片,去離子水孵育,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,加封閉液,加一抗過(guò)夜,加生物素化山羊抗小鼠IgG,孵育20 min。PBS沖洗共3次,加SABC,孵育20 min,PBS沖洗共4次。DAB顯色,蘇木素復(fù)染,二甲苯脫水,封片。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析及t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞VEGF-C mRNA表達(dá)的影響

    空白對(duì)照組表達(dá)率為(98.6±2.4)%,陰性對(duì)照組表達(dá)率為(98.1±2.0)%,實(shí)驗(yàn)A組表達(dá)率為(38.2±1.6)%,實(shí)驗(yàn)B組表達(dá)率為(64.2±1.8)%,實(shí)驗(yàn)C組表達(dá)率為(67.9±1.9)%。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組VEGF-C mRNA表達(dá)率無(wú)顯著差異(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組各組的表達(dá)水平均顯著低于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)A組的表達(dá)又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

    2.2重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中VEGF-C蛋白水平的影響

    陰性對(duì)照組VEGF-C蛋白水平為(383.51±30.26)pg/mL,空白對(duì)照組為(368.80±38.91)pg/mL,實(shí)驗(yàn)A組為(116.38±25.16)pg/mL,實(shí)驗(yàn)B組為(277.42±30.11)pg/mL,實(shí)驗(yàn)C組為(291.46±33.15)pg/mL。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組培養(yǎng)液上清中VEGF蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)組各組蛋白水平均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)A組蛋白水平又顯著低于實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組(P均<0.01)。見(jiàn)圖2。

    2.3 重組質(zhì)粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白表達(dá)的影響

    各組乳腺癌細(xì)胞內(nèi)VEGF-C蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖3~7。VEGF-C蛋白陽(yáng)性可見(jiàn)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染色顏色均較深,為棕黃色,實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組染色均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組淺,而又以實(shí)驗(yàn)A組染色最淺。

    3討論

    VEGF-C是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子家族成員,具有促進(jìn)血管增生的作用,在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。而癌癥細(xì)胞分泌VEGF-C與其自身膜受體結(jié)合,能夠促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖,抑制癌細(xì)胞凋亡,降低癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。VEGF-C在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)[5]。目前針對(duì)VEGF-C為靶點(diǎn)的治療主要有抑制VEGF-C受體的酪氨酸激酶活性、抗體封閉、降低VEGF-C及其受體的表達(dá),但這些技術(shù)或方法均有一定的局限性。RNA干擾由雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異的同源基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄后發(fā)生的基因沉寂現(xiàn)象,其作用機(jī)制是小干擾RNA(siRNA)作為中介分子,與其他一些蛋白質(zhì)構(gòu)成沉默復(fù)合物,按照堿基互補(bǔ)規(guī)律,識(shí)別降解與siRNA同源的mRNA[6-8]。siRNA干擾是一種高效的、特異的基因表達(dá)抑制技術(shù),廣泛用于基因治療相關(guān)的研究。該技術(shù)經(jīng)人工合成靶向的siRNA,或者構(gòu)建相應(yīng)的載體,導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞,能夠特異性抑制基因的表達(dá)。

    1996年VEGF-C首次從前列腺腫瘤細(xì)胞中被分離出來(lái),與VEGF家族其他成員具有同源性。VEGF-C在人類多種惡性腫瘤中均有高表達(dá)。VEGF-C在腫瘤組織中的高表達(dá),結(jié)合腫瘤周圍組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VEGF-R3,誘發(fā)形成腫瘤相關(guān)淋巴管,增加淋巴管與腫瘤細(xì)胞的接觸,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移[9,10]。表達(dá)VEGF-C的乳腺癌細(xì)胞更具有侵襲性,更容易經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移。正常的乳腺組織并不表達(dá)VEGF-C及VEGFR-3,而乳腺癌組織中會(huì)出現(xiàn)不同程度表達(dá)率,并且有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)者。研究顯示,腫瘤細(xì)胞分泌VEGF-C,特異性結(jié)合自身表面受體,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,上調(diào)Bcl-2/Bax值,抑制癌細(xì)胞的凋亡,降低癌細(xì)胞的化療敏感性。目前針對(duì)VEGF-C及其受體的抗腫瘤治療方法有多種方式。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn),利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),使具有正常免疫力的小鼠MT-450乳腺癌模型中的乳腺癌細(xì)胞異位表達(dá)VEGFR-3-Ig,具有阻斷VEGF-C活性的效果,抑制局部轉(zhuǎn)移及肺轉(zhuǎn)移。抗纖維蛋白溶酶能夠抑制VEGF-C水解,阻止其不能結(jié)合VEGF-R3。這些基因靶向治療方法能夠發(fā)揮作用,但具有一定的局限性。

    RNA干擾具有高效、高特異性的效果,采用該技術(shù)抑制VEGF-C的基因表達(dá),為腫瘤治療提供了一種新的方法。siRNA為與目的基因同源的RNA,通常19~25個(gè)核苷酸長(zhǎng)度,轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,與內(nèi)切酶形成誘導(dǎo)沉默復(fù)合體,以siRNA為模板,識(shí)別并剪切、降解同源基因mRNA,形成瀑布效應(yīng),使細(xì)胞表現(xiàn)為目的基因缺陷表型。RNA干擾技術(shù)具有高效、特異、毒性小等優(yōu)點(diǎn),能夠高效抑制特定基因的表達(dá),與反義核苷酸技術(shù)比較,具有更簡(jiǎn)易、方便的特點(diǎn)[11,12]。

    MCF-7乳腺癌細(xì)胞株屬于高表達(dá)VEGF-C細(xì)胞株,因此本次研究選擇此細(xì)胞株作為研究對(duì)象。siRNA的干擾作用具有劑量和時(shí)間依賴性,轉(zhuǎn)染后24~48 h,干擾效應(yīng)逐漸明顯,48~72 h達(dá)到最高,因此本次實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)染后48 h為檢測(cè)點(diǎn)[13,14]。RT-PCR是測(cè)定目的基因表達(dá)情況的常用方法,具有簡(jiǎn)便、半定量的效果。VEGF-C/β-actin比值表示VEGF-C基因的相對(duì)表達(dá)量。本次研究中,陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組VEGF-C基因表達(dá)相當(dāng),而實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組表達(dá)明顯降低,又以實(shí)驗(yàn)A組的基因表達(dá)率最低。VEGF-C屬于分泌蛋白,對(duì)培養(yǎng)液上清液中VEGF-C水平的檢測(cè)采用ELISA法,以檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞VEGF-C的分泌情況。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組上清液中VEGF-C水平顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,又以實(shí)驗(yàn)A組水平最低。這兩個(gè)結(jié)果均提示RNA干擾后乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因表達(dá)及分泌水平顯著下降,又以pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的抑制作用最強(qiáng)。本次研究觀察各組細(xì)胞中VEGF-C蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示細(xì)胞漿中可見(jiàn)呈棕黃色顆粒。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組染色較深,而RNA干擾后實(shí)驗(yàn)A組、實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組染色程度均較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組淺,而以實(shí)驗(yàn)A組的染色更淺。提示RAN干擾能夠抑制乳腺癌細(xì)胞VEGF-C蛋白的表達(dá),尤其以pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的抑制作用最強(qiáng)。

    綜上所述,靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體可抑制人乳腺癌細(xì)胞VEGF-C基因、蛋白的表達(dá),對(duì)蛋白分泌有抑制作用,而不同的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果也存在一些差異,以pRNAT-VEGF-C-1質(zhì)粒的抑制效果最顯著。

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    (收稿日期:2014-12-03)

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