L-α-甘油磷脂酰膽堿的制備研究進展

朱超，夏建才，朱麗

（云南開放大學化學工程學院，云南昆明 650500）

L-α-甘油磷脂酰膽堿的制備研究進展

朱超，夏建才，朱麗

（云南開放大學化學工程學院，云南昆明 650500）

L-α-甘油磷脂酰膽堿（L-α-glycerol phosphatidylcholine，L-α-GPC）是具有良好生物活性的小分子物質(zhì)，在人和動物體內(nèi)大量存在，參與中間代謝，發(fā)揮著至關(guān)重要的生理作用，是磷脂改性研究的一個重要組成部分。介紹并對比了L-α-GPC的各種制備方法，全合成法具有產(chǎn)物分離容易、純度高的優(yōu)勢，但存在原料昂貴、藥學性質(zhì)不同等缺點；半合成法具有原料廉價易得、收率高的特點，成為當前研究的主流。

磷脂；L-α-甘油磷脂酰膽堿；制備

L-α-甘油磷脂酰膽堿（L-α-glycerol phosphatidylcholine，L-α-GPC）是具有良好生物活性的小分子物質(zhì)，在人和動物細胞膜、腦部、血漿、肝臟等器官中大量存在，參與中間代謝，在人的神經(jīng)、記憶、生殖等生理功能上發(fā)揮著重要作用，同時它還是一個重要的化學合成中間體［1-4］。其分子由一個非極性頭（甘油）和一個極性頭（磷脂酰膽堿）組成，因而具有兩性特性，此外，分子內(nèi)存在季胺堿正電荷和磷酸負電荷，為一個分子內(nèi)鹽，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 L-α-GPC的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of L-α-GPC

高純度的L-α-GPC在常溫常壓下穩(wěn)定，為具有黏性的無色透明液體，但久置在空氣中易被氧化而顏色變深，國產(chǎn)的部分L-α-GPC因含有色素、非極性雜質(zhì)而呈黃色，其儲存條件一般為－20℃密封保存。低純度的L-α-GPC藥理作用弱，還可能產(chǎn)生毒素，我國的藥用L-α-GPC主要靠進口，價格十分昂貴，1 g純度大于95%的L-α-GPC的價格接近1 000美元［5］。所以，改進生產(chǎn)工藝以提高L-α-GPC的純度和收率具有十分重要的意義。

1 全合成法制備L-α-GPC

L-α-GPC的全合成主要是以較純的對映異構(gòu)體，如（S）-2，2-二甲基-1，3-二氧-4-甲醇、（L）-甘油-3-磷酸、D-亞異丙基甘油等［6］為起始原料，經(jīng)過幾步縮合反應(yīng)而得到。

Puricelli［7］用亞異丙基甘油與2-氯-2-氧-1，3，2-環(huán)氧磷戊烷為原料，經(jīng)取代、縮合、水解、陽離子樹脂提純、乙醇重結(jié)晶得到L-α-GPC。得到的產(chǎn)物因起始原料的旋光性的不同而具有不同的旋光性。但是，2-氯-2-氧-1，3，2-環(huán)氧磷戊烷不穩(wěn)定，其制備工藝復(fù)雜，環(huán)境污染大，難以應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)中。反應(yīng)路線見圖2。

圖2 以亞異丙基甘油為起始原料的L-α-GPC制備方法Fig.2 Preparation method of L-α-GPC using isopropylideneglycerol as startingmaterial

隨后，Puricelli［7］又以D-亞異丙基甘油對甲苯磺酸酯為起始原料，與磷酸膽堿四甲基銨鹽反應(yīng)，一步制備L-α-GPC。優(yōu)點是中間體穩(wěn)定易分離，且收率高達75%。缺點是起始原料成本較高。反應(yīng)路線見圖3。

圖3 以D-亞異丙基甘油對甲苯磺酸酯為原料的L-α-GPC制備方法Fig.3 Preparation method of L-α-GPC using D-isopropylideneglycidyl tosylate as startingmaterial

Song等［8］運用shapless環(huán)氧開環(huán)原理，以磷酸膽堿水合鹽為起始原料，經(jīng)酸解、縮合得到甘油磷酸膽堿鹽晶體，再經(jīng)離子交換樹脂除去氯離子，得到L-α-GPC。該方法工藝簡潔，起始原料便宜，交換樹脂用量少，但原料不穩(wěn)定，不易保存，且總收率低于50%。反應(yīng)路線見圖4。

圖4 Song等的L-α-GPC制備方法Fig.4 Preparation m ethod of L-α-GPC by Song，et al.

Lee等［9］先用芐基對縮水甘油進行保護，經(jīng)開環(huán)、?；?、氫化得到1，2-二乙酰甘油，再與三甲胺反應(yīng)，最后水解得到L-α-GPC，收率58%，此反應(yīng)路線長、收率不高，同時也存在三甲胺不易儲存等問題。

陳新等［10］針對縮水甘油穩(wěn)定性不高、難以純化的缺陷，提出先將縮水甘油制備成穩(wěn)定、易分離的縮水甘油對甲苯磺酸酯，再與磷酸膽堿四乙基銨鹽反應(yīng)，再純化得到L-α-GPC，收率75.6%。反應(yīng)路線見圖5。

圖5 陳新等的L-α-GPC制備方法Fig.5 Preparation method of L-α-GPC by Chen Xin，et al.

全合成法具有產(chǎn)物分離容易、純度高的優(yōu)勢，但是存在反應(yīng)起始原料需要純對映異構(gòu)體，價格昂貴，產(chǎn)物與天然產(chǎn)物的藥理性質(zhì)存在一定的差異，而且一些反應(yīng)中間體制備、儲存困難等缺點，所以應(yīng)用上仍然受到很大限制。

2 半合成法制備L-α-GPC

半合成法制備L-α-GPC的方法是：先從自然界中提純得到磷脂化合物，再對其進行脫酰反應(yīng)制得。磷脂化合物的結(jié)構(gòu)式見圖6，當R3為磷脂酰膽堿（PC）時，如果只脫掉1位、2位脂肪酸，3位磷脂鍵保留，就可得到目標產(chǎn)物L-α-GPC。

圖6 磷脂化合物的結(jié)構(gòu)式Fig.6 Structural formula of phospholipids com pounds

2.1 磷脂酰膽堿（PC）的提純

雖然磷脂廣泛存在于自然界中，但從動物中提取磷脂的成本較高，且純度較低；從植物中提取磷脂兼具純度和成本的優(yōu)勢，而大豆磷脂是大豆油精煉時的副產(chǎn)品，且磷脂含量高，是研究得最多也是最為重要的磷脂來源。天然的大豆磷脂是混合物，除含有磷脂酰膽堿（PC）外，還含有磷脂酰乙醇胺（PE）、磷酯酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、磷脂酰絲氨酸（PS）等磷脂組分。PC含量一般僅為20%～40%［11］，且純的PC價格十分昂貴，所以一般以磷脂的混合物作為原料。由于混合物中其它類型的磷脂也可以進行脫酰反應(yīng)得到對應(yīng)的單甘油磷脂?；衔铮ǚ謩e為GPE、GPI、GPA、GPS），所以，為了減小反應(yīng)后的分離壓力，在進行脫酰反應(yīng)前需要進行提純。目前，國內(nèi)外純化PC的方法主要有：溶劑萃取法、柱層析法、超臨界流體萃取法、膜分離法等［12］。

溶劑萃取法是提純卵磷脂的常用方法，具有生產(chǎn)工藝簡單、流程短、便于連續(xù)操作等優(yōu)點。單一溶劑（如乙醇）的萃取效果不如混合溶劑，但混合溶劑回收較困難。經(jīng)初步萃取的粗品可以利用金屬離子處理，產(chǎn)品的PC含量在85%以上，但容易被金屬離子污染。吸附柱層析法和離子交換柱層析法可以得到高純度的PC，但是處理量小，洗滌溶劑用量大，蒸發(fā)溶劑能耗大，難以實現(xiàn)工業(yè)化。國外在超臨界流體萃取法提純磷脂方面做了大量工作［13］。此外，提純磷脂的非常規(guī)方法還有酶催化精制法、酶預(yù)水解法、高壓脈沖電場法等，都還處于研究的初始階段。

2.2 磷脂酰膽堿的脫酰反應(yīng)

磷脂的脫酰反應(yīng)，主要是磷脂化合物在水溶液或低碳醇作為溶劑的體系中，在催化劑的存在下發(fā)生酯交換反應(yīng)（圖7）。酯交換催化劑主要有生物酶、堿性催化劑、酸性催化劑3類。以磷脂酰膽堿為原料合成L-α-GPC，需要合適的催化劑使1、2位發(fā)生反應(yīng)，而3位磷脂鍵保留。

圖7 磷脂脫酰酯交換反應(yīng)制備L-α-GPCFig.7 Preparation of L-α-GPC by deacylation transesterification reaction equation of phospholipid compound

在生物體代謝過程中，存在多種可以水解甘油磷脂酯鍵的磷脂酶類。磷脂酶A1和A2可分別使甘油磷脂的第1位和第2位酯鍵斷裂；磷脂酶B能脫去溶血磷脂的脂肪酸；磷脂酶C、D可使3位磷酸酯鍵水解。Uziel等從干燥的青霉菌絲中提取得到溶血卵磷脂酶B，可以選擇性地使純的溶血磷脂脫去一個脂肪酸得到L-α-GPC，收率能達到45%～60%，但是此酶對脂肪酸的飽和度的選擇性存在差異，而且要求溶血磷脂必須是單酰化取代L-α-GPC，即必須是溶血磷脂，反應(yīng)路線見圖8。總之，一般情況下，生物酶對于底物的要求具有專一性，且要大量得到則需要靠細菌的大量繁殖分泌，所以，尋找能分泌催化特定酯基脫落的酶是主要任務(wù)。

圖8 青霉菌絲催化溶血磷脂脫酰反應(yīng)Fig.8 Deacylation reaction of lysophosphatide catalyzed by m ycelia of Penicillium

酸性催化劑如硫酸和苯磺酸，催化效率低，且會產(chǎn)生大量廢酸，已基本淘汰，偶爾用作高酸值的原料。常用的堿性催化劑有KOH、NaOH、甲醇鈉、Na2CO3等，具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高等特點，是工業(yè)上最常用的催化劑。Evans等［14］用甲醇鈉水解低濃度（大約2 g·L－1）的卵磷脂溶液后得到粗GPC，再經(jīng)提純處理，得到純的L-α-GPC，收率達96.8%。Robles等［15］采用甲醇鋰醇解從粉末蛋黃中萃取的磷脂也得到了L-α-GPC。但使用甲醇鈉作為催化劑的反應(yīng)也存在問題：在酰氧基斷裂的同時，會造成部分P－O鍵的斷裂，得到一些對人體有害的副產(chǎn)物。Okui提出用堿土金屬進行水解反應(yīng)，但是產(chǎn)物摻雜大量的副產(chǎn)物。Brockerhoff等將水解催化劑換為季銨堿（四丁基氫氧化銨），水解過程與Chadha［16］的結(jié)果一致，但是四丁基氫氧化銨價格昂貴，得到的產(chǎn)物不是游離的L-α-GPC，而是四丁基氫氧化銨鹽的復(fù)合物，需要再進行結(jié)晶操作，不易大規(guī)模生產(chǎn)和重現(xiàn)性不高都使其應(yīng)用受到制約。

由此可見，當使用堿性催化劑催化脫酰反應(yīng)時，需要控制好堿性的強弱。堿性過強，則易使磷脂的磷脂鍵水解；而堿性偏弱，既浪費原料，又需要更長的反應(yīng)時間。另外，金屬離子的去除需要消耗大量的酸、堿、樹脂。

近年來，有學者開始使用固體堿催化劑，得到了較一般堿性催化劑更好的結(jié)果。de Ferra等［17］以甲醇為溶劑，采用強堿性離子交換樹脂作為催化劑，與PC進行酯交換反應(yīng)，同時利用堿性樹脂本身的吸附性，初步分離，制備得到L-α-GPC。該法快速、工藝簡單，收率和晶形都比較好。

2.3 反應(yīng)產(chǎn)物的提純

雖然磷脂經(jīng)過提純后，PC含量顯著提升，但是原料中仍含有一定量的PE、PI、PS、PA，它們水解后則分別得到GPE、GPI、GPS、GPA。除此之外，反應(yīng)混合物還含有脂肪酸甲酯、中性脂類等。脂肪酸甲酯和中性脂類可以用石油醚等非極性溶劑萃取除去，但是L-α-GPC、GPE、GPI、GPS等物質(zhì)極性相近，且大都帶有弱堿性，所以它們的分離提純是需要解決的主要問題。

最初提純L-α-GPC的方法主要是采用形成金屬復(fù)合物的方法。美國專利介紹了一種用過量的AgCl處理反應(yīng)液使副產(chǎn)物沉淀，再用H2S和BaCO3除去過量的銀離子，但是銀離子不能完全除盡。Hanahan等、Tattrie等通過形成氯化鎘復(fù)合物的方法提純L-α-GPC，再用大量樹脂去除鎘離子。由于得到的產(chǎn)物不是游離的L-α-GPC，需要使用離子交換樹脂去除氯化鎘，導(dǎo)致純化非常復(fù)雜，收率較低，而最主要的問題是：即使微量的鎘離子存在，毒性仍然相當大，不能用于工業(yè)生產(chǎn)。Tronconi等［18］報道了一種從磷脂脫?；旌衔镏蟹蛛xL-α-GPC和GPE的方法，即向混合物中加入ZnCl2，形成（GPC+GPE）ZnCl2混合沉淀，再用吡啶置換出ZnCl2，得到純的GPC和GPE混合物，再通過強堿離子樹脂分離得到GPC、GPE，其工藝流程見圖9。但是此工藝存在操作步驟多、選擇性不強、產(chǎn)率不夠高等缺點。

圖9 Tronconi等的工藝路線Fig.9 Process route by Tronconi，et al.

為了得到不含金屬離子的游離L-α-GPC，人們用樹脂對反應(yīng)混合物進行分離，取得了很好的效果。Tronconi等［18］先用堿金屬將脫酰反應(yīng)混合物中的GPS沉淀出來，再用陽離子樹脂、強堿性離子樹脂分離得到L-α-GPC與GPE。此方法樹脂用量少，收率和純度都相對較高。de Ferra等［17］研究了強堿性離子交換樹脂作為催化劑處理粗磷脂的醇提取液，以甲醇為溶劑進行酯交換反應(yīng)，得到L-α-GPC、GPE、GPI。利用堿性樹脂本身的吸附性，使用不同的洗滌液將不同的產(chǎn)物洗滌下來，達到了分離的效果。反應(yīng)、分離同時在一個容器進行，具有工藝簡單、迅速、收率和純度都比較高的特點。

3 結(jié)語

全合成法得到的L-α-GPC純度比較高，收率高，但原料比較昂貴，而且可能有劇毒，不易儲存，合成工藝路線長；半合成法具有原料廉價易得、收率高的優(yōu)點。制備高純度具有醫(yī)用價值的L-α-GPC將是研究的主要方向，其中采用離子交換樹脂作為催化劑和分離介質(zhì)具有高效、快速等優(yōu)點，應(yīng)加大研究開發(fā)的力度。

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Research Progress on Preparation of L-α-Glycerol Phosphatidylcholine

ZHU Chao，XIA Jian-cai，ZHU Li
（School of Chemical Engineering，Yunnan Open University，Kunming 650500，China）

L-α-Glycerol phosphatidylcholine（L-α-GPC）is smallmolecule with good biological activity and abounds in human and animal body，which plays critical physiological role in themetabolism.Ithas become an important research direction ofmodification of phospholipids.Various preparationmethods of L-α-GPC were introduced and compared.Total syntheticmethod had the advantages of high purity and easy in separation，but the raw materials were expensive，and pharmaceutical propertieswere different.Semi-synthetic method had the advantages of high yield and thematerialswere cheap and readily available，which became themainstream of the present study.

phospholipids；L-α-glycerol phosphatidylcholine；preparation

TQ 645.9

A

1672-5425（2015）07-0005-04

10.3969/j.issn.1672－5425.2015.07.002

云南省教育廳科學研究基金一般項目（2013Y182）

2015-03-02

朱超（1986－），男，重慶人，博士，講師，研究方向：磷脂的提純、分離、檢測，E-mail：mikejoid@163.com。